(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 107043818 A(43)申请公布日 2017.08.15
(21)申请号 201710219319.7(22)申请日 2017.04.06
(71)申请人 西北民族大学
地址 730000 甘肃省兰州市城关区西北新
村1号(72)发明人 张国华 卢建雄 蒲长宇 王戊腾
安得霞 陈妍 (74)专利代理机构 北京挺立专利事务所(普通
合伙) 11265
代理人 倪钜芳(51)Int.Cl.
C12Q 1/68(2006.01)
权利要求书2页 说明书7页 附图3页
CN 107043818 A(54)发明名称
一种基于实时荧光PCR定量检测肉制品猪源性成分的方法(57)摘要
本发明涉及生物制品检测技术领域，特别是一种基于实时荧光PCR定量检测肉制品猪源性成分的方法。包括猪DNA的PCR特异性引物选择、定量检测标准曲线模型建立、待测产品的基因组DNA提取、待测产品PCR扩增、PCR扩增灵敏度及扩增效率检测，已建立的动物源性成分PCR检测方法主要为定性检测，而肉制品中肉的实际含量以及掺假食品中掺假量也是消费者关注的问题。为此，我们采用实时荧光PCR相对定量法通过制作标准曲线，建立定量检测猪源性成分含量的方法。以猪源性成分含量已知的混合肉样DNA为模板，以β-actin基因为内参，检测Cyt b基因，建立定量分析的标准曲线，以猪源性成分含量不同的混合肉样DNA对标准曲线进行了验证，检测值与实际含量符合程度高，回收率达99.85-102.60%。
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权 利 要 求 书
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1.一种基于实时荧光PCR定量检测肉制品猪源性成分的方法，其特征在于包括如下步骤：
A、猪DNA的PCR特异性引物选择
特异性扩增猪DNA的PCR引物选择畜禽线粒体细胞色素b-cytochrome b，Cyt b基因DNA序列，以其变异区域为模板设计引物序列，Cyt b上游引物为 5’-CATGCGTATCACCACCATTATAT-3’，下游引物为5’-TGCCAAGCGGGTTGCT-3’，产物大小100 bp；以β-actin为内参，通用扩增引物，上游引物为5’-GATCGTGCGGGACATCAA-3’，下游引物为5’-AGGAAGGAGGGCTGGAAGA G-3’，产物大小180 bp；
B、定量检测标准曲线模型建立牛、羊、鸡和鸭肉样品按1:1:1:1混合后，混合样品中添加猪肉样品，猪肉样品添加比例为0、1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%，试剂SYBR®Premix Ex Taq II中加入PCR 上、下游引物、ROX参考染料ROX Reference Dye、DNA样品和双蒸水ddH2O，调整DNA样品浓度为50ng /μL，变形处理为 95℃预变性处理30s、95℃变性处理5s、℃退火处理34s，变形处理循环40次，以β-actin为内参，不同添加比例的猪肉样品为对照，采用相对定量法计算DDCT法及2-DDCt值，得出y = 3075.5x + 160.83——y: 2-DDCt值，x:猪源性成分百分含量；
C、待测产品的基因组DNA提取
取20mg待测动物组织样品放入2ml离心管中，加入蛋白酶K消化时间4h，选用TIANGEN组织基因组DNA提取试剂盒，加入200µl缓冲液GB，上下颠倒混匀15秒，70℃放置13min，转速12 000rpm离心处理2min，将离心处理的溶液悬空滴加至吸附膜中部，室温下放置5min，DNA样品置-20℃冰箱保存；
D、待测产品PCR扩增试剂SYBR®Premix Ex Taq II中加入PCR 上、下游引物、ROX参考染料ROX Reference Dye、DNA样品和双蒸水ddH2O，变形处理为 95℃预变性处理30s、95℃变性处理5s、℃退火处理34s，变形处理循环30-40次；
E、PCR扩增灵敏度及扩增效率检测检测待测产品的Cyt b引物扩增的灵敏度及Cyt b和β-actin引物的扩增效率，通过步骤B定量检测标准曲线模型计算得出检测肉制品猪源性成分含量，实现定量检测肉制品猪源性成分。
2.根据权利要求1所述一种基于实时荧光PCR定量检测肉制品猪源性成分的方法，其特征在于还包括步骤F、定量检测标准曲线模型检测：牛、羊、鸡和鸭肉样品按1:1:1:1混合后，混合样品中添加猪肉样品，猪肉样品添加比例为0、5、35、55和75%，试剂SYBR®Premix Ex Taq II中加入PCR 上、下游引物、ROX参考染料ROX Reference Dye、DNA样品和双蒸水ddH2O，调整DNA样品浓度为50ng /μL，变形处理为 95℃预变性处理30s、95℃变性处理5s、℃退火处理34s，变形处理循环40次，以β-actin为内参，不同添加比例的猪肉样品为对照，采用相对定量法计算DDCT法及2-DDCt值，检测步骤B的曲线模型。
3.根据权利要求1所述一种基于实时荧光PCR定量检测肉制品猪源性成分的方法，其特征在于所述步骤D中变形处理为 95℃预变性处理30s、95℃变性处理5s、℃退火处理34s，变形处理循环40次。
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权 利 要 求 书
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4.根据权利要求1所述一种基于实时荧光PCR定量检测肉制品猪源性成分的方法，其特征在于所述步骤C中选用TIANGEN组织基因组DNA提取试剂盒，型号DP304。
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说 明 书
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一种基于实时荧光PCR定量检测肉制品猪源性成分的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物制品检测技术领域，特别是一种基于实时荧光PCR定量检测肉制品猪源性成分的方法。
背景技术
[0002]随着人们生活水平的不断提高，食品安全与伦理受到越来越多的关注，然而，肉制品虚假标签及掺假和低价猪肉、鸭肉冒充牛肉、羊肉等欺诈性替代时有发生，瘦肉精事件、三聚氰胺牛奶事件、二恶英事件等更是加剧了社会及消费者对动物产品安全的担忧。基于经济、宗教和健康等方面的因素，对动物源性成分进行快速、准确地检测势在必行。近年来，我国已制定了一些检测食品、化妆品和饲料中动物源性成分的方法和标准（GB/T 21101-2007, SN/T 2051-2008)，但其检测方法仍存在灵敏度不够、不能定量及不易推广使用等方面的缺陷。因此，本实验通过设计检测猪源性成分的PCR特异性引物，建立利用实时荧光PCR技术定性、定量检测猪源性成分的方法。发明内容
[0003]本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性高、可实现猪肉成分定量检测的基于实时荧光PCR定量检测肉制品猪源性成分的方法。[0004]本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：
一种基于实时荧光PCR定量检测肉制品猪源性成分的方法，包括如下步骤：A、猪DNA的PCR特异性引物选择
特异性扩增猪DNA的PCR引物选择畜禽线粒体细胞色素b-cytochrome b，Cyt b基因DNA序列，以其变异区域为模板设计引物序列，Cyt b上游引物为 5’-CATGCGTATCACCACCATTATAT-3’，下游引物为5’-TGCCAAGCGGGTTGCT-3’，产物大小100 bp；以β-actin为内参，通用扩增引物，上游引物为5’-GATCGTGCGGGACATCAA-3’，下游引物为5’-AGGAAGGAGGGCTGGAAGA G-3’，产物大小180 bp；
B、定量检测标准曲线模型建立牛、羊、鸡和鸭肉样品按1:1:1:1混合后，混合样品中添加猪肉样品，猪肉样品添加比例为0、1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%，试剂SYBR®Premix Ex Taq II中加入PCR 上、下游引物、ROX参考染料ROX Reference Dye、DNA样品和双蒸水ddH2O，调整DNA样品浓度为50ng /μL，变形处理为 95℃预变性处理30s、95℃变性处理5s、℃退火处理34s，变形处理循环40次，以β-actin为内参，不同添加比例的猪肉样品为对照，采用相对定量法计算DDCT法及2-DDCt值，得出y = 3075.5x + 160.83——y: 2-DDCt值，x:猪源性成分百分含量；
C、待测产品的基因组DNA提取
取20mg待测动物组织样品放入2ml离心管中，加入蛋白酶K消化时间4h，选用TIANGEN组织基因组DNA提取试剂盒，加入200µl缓冲液GB，上下颠倒混匀15秒，70℃放置13min，转速12
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000rpm离心处理2min，将离心处理的溶液悬空滴加至吸附膜中部，室温下放置5min，DNA样品置-20℃冰箱保存；
D、待测产品PCR扩增试剂SYBR®Premix Ex Taq II中加入PCR 上、下游引物、ROX参考染料ROX Reference Dye、DNA样品和双蒸水ddH2O，变形处理为 95℃预变性处理30s、95℃变性处理5s、℃退火处理34s，变形处理循环30-40次；
E、PCR扩增灵敏度及扩增效率检测检测待测产品的Cyt b引物扩增的灵敏度及Cyt b和β-actin引物的扩增效率，通过步骤B定量检测标准曲线模型计算得出检测肉制品猪源性成分含量，实现定量检测肉制品猪源性成分。
[0005]还包括步骤F、定量检测标准曲线模型检测：牛、羊、鸡和鸭肉样品按1:1:1:1混合后，混合样品中添加猪肉样品，猪肉样品添加比例为0、5、35、55和75%，试剂SYBR®Premix Ex Taq II中加入PCR 上、下游引物、ROX参考染料ROX Reference Dye、DNA样品和双蒸水ddH2O，调整DNA样品浓度为50ng /μL，变形处理为 95℃预变性处理30s、95℃变性处理5s、℃退火处理34s，变形处理循环40次，以β-actin为内参，不同添加比例的猪肉样品为对照，采用相对定量法计算DDCT法及2-DDCt值，检测步骤B的曲线模型。[0006]所述步骤D中变形处理为 95℃预变性处理30s、95℃变性处理5s、℃退火处理34s，变形处理循环40次。
[0007]所述步骤C中选用TIANGEN组织基因组DNA提取试剂盒，型号DP304。[0008]本发明的有益效果为：
1、猪DNA的PCR特异性引物选择，设计特异性扩增猪DNA的PCR引物是检测猪源性成分的前提条件，因此通过分析比对猪与其他畜禽线粒体细胞色素b基因DNA序列，以其变异区域为模板设计引物序列，经Real-time PCR扩增，猪肌肉样品DNA 检测到较强的荧光强度，即Ct值低；虽然牛、羊、鸡和鸭肌肉样品DNA也检测到极弱的荧光强度，但其Ct值＞30，高于或接近无动物源性成分的空白对照。在理论上，空白对照及无猪源性成分样品DNA扩增时不会产生荧光信号，但实际操作中，往往由于仪器、试剂、引物及镁离子浓度等原因，即使严格控制DNA模板不受污染，也均在30循环后出现扩增曲线，应为假阳性，说明所设计的引物具有较好的物种特异性。所述步骤D中变形处理为 95℃预变性处理30s、95℃变性处理5s、℃退火处理34s，变形处理循环40次，完整呈现扩增曲线，便于检测结果清晰呈现。[0009]2、鉴于实际工作中由于食品加工等原因极有可能存在DNA提取量过低的问题及对清真食品的要求，需要检测方法有很高的灵敏度。以普通PCR方法检测熟肉制品，检测的灵敏度仅为 5 %，而采用实时PCR方法，检测牛、羊肉制品中掺杂猪源性成分的检测限可达1×10-6ng/ μL。本试验中，将猪DNA倍比稀释，分析其DNA最低检测量。当DNA浓度低至5×10-5
ng/μL时，扩增曲线仍然完整、清晰，Ct值高于空白对照，说明该方法有较高的灵敏度。[0010]3、已建立的动物源性成分PCR检测方法主要为定性检测，而肉制品中肉的实际含量以及掺假食品中掺假量也是消费者关注的问题。为此，我们采用实时荧光PCR相对定量法通过制作标准曲线，建立检测猪源性成分含量的方法。以猪源性成分含量已知的混合肉样DNA为模板，线性回归利用数理统计中回归分析，来确定两种或两种以上变量间相互依赖的定量关系的一种统计分析方法，运用十分广泛。回归分析中，只包括一个自变量和一个因变
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量，且二者的关系可用一条直线近似表示，这种回归分析称为一元线性回归分析。我们在此做的就是线性回归，即找出猪源性成分百分含量(x)与2-DDCt值（y）间的回归关系。R²为判定系数，是判定线性回归直线拟合度好坏的判定指标，为R的平方（R的计算公式如下）。线性相关系数R是衡量两个随机变量之间线性相关程度的指标,它由卡尔·皮尔森（Karl Pearson）在1880年代提出，现已广泛地应用于科学的各个领域。其中图4和图5中的R²由不同的变量计算得出，以β-actin基因为内参，检测Cyt b基因，建立定量分析的标准曲线，结果显示2-DDCt值与混合肉样中猪源性成分的含量有显著的线性关系（R² = 0.9914）。以猪源性成分含量不同的混合肉样DNA对标准曲线进行了验证，检测值与实际含量符合程度高，回收率99.85-102.60%，在一般允许范围内。选择合适的内参基因对目的基因标准化，消除样品组成不均一性、DNA提取过程、提取批次等对DNA提取量、取样量的影响，从而使扩增曲线和检测结果更为可靠。本试验中，将猪肉组织与其他动物组织按比例混合，以2-DDCt值制作标准曲线，以排除实际检测中由于样品组成复杂而可能对扩增造成的影响。[0011]现有的食品中猪源性成分检测方法中，认为Ct值限定在35循环以内，在检测的特异性、灵敏性和假阳性控制方面均可达到较好的效果。然而，也有将Ct值检测阳性限定为30循环，与此类似，我们对牛、羊、鸡和鸭等无猪源性成分肌肉样品DNA检测实验中，常会检测到微弱的荧光信号，虽然扩增循环数或Ct值高于或接近空白对照，但仍有较完整的扩增曲线，在实际工作中会给是否含有猪源性成分的准确定性判断带来干扰；如果结合定量分析，用无物种特异性扩增的内参基因Ct值对目的基因标准化，并与无猪源性成分的对照组比较（如表3、4所示），则可排除“假阳性”，增强定性判断的可靠性。附图说明
[0012]图1为不同基因组DNA电泳图；
图2为猪、牛、羊、鸡和鸭DNA Real-time PCR扩增曲线；图3为猪DNA系列稀释后的Real-time PCR扩增曲线；图4为 Cyt b和β-actin引物扩增效率分析示意图；图5为 定量检测标准曲线模型示意图；图6为准确性验证PCR扩增曲线；图7市售火腿肠样品PCR扩增曲线。
具体实施方式
[0013]一种基于实时荧光PCR定量检测肉制品猪源性成分的方法，包括如下步骤：
A、猪DNA的PCR特异性引物选择
特异性扩增猪DNA的PCR引物选择畜禽线粒体细胞色素b-cytochrome b，Cyt b基因DNA序列，以其变异区域为模板设计引物序列，Cyt b上游引物为 5’-CATGCGTATCACCACCATTATAT-3’，下游引物为5’-TGCCAAGCGGGTTGCT-3’，产物大小100 bp；以β-actin为内参，通用扩增引物，上游引物为5’-GATCGTGCGGGACATCAA-3’，下游引物为5’-AGGAAGGAGGGCTGGAAGA G-3’，产物大小180 bp；
B、定量检测标准曲线模型建立牛、羊、鸡和鸭肉样品按1:1:1:1混合后，混合样品中添加猪肉样品，猪肉样品添加比例
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为0、1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%，试剂SYBR®Premix Ex Taq II中加入PCR 上、下游引物、ROX参考染料ROX Reference Dye、DNA样品和双蒸水ddH2O，调整DNA样品浓度为50ng /μL，变形处理为 95℃预变性处理30s、95℃变性处理5s、℃退火处理34s，变形处理循环40次，以β-actin为内参，不同添加比例的猪肉样品为对照，采用相对定量法计算DDCT法及2-DDCt值，得出y = 3075.5x + 160.83——y: 2-DDCt值，x:猪源性成分百分含量；
C、待测产品的基因组DNA提取
取20mg待测动物组织样品放入2ml离心管中，加入蛋白酶K消化时间4h，选用TIANGEN组织基因组DNA提取试剂盒，加入200µl缓冲液GB，上下颠倒混匀15秒，70℃放置13min，转速12 000rpm离心处理2min，将离心处理的溶液悬空滴加至吸附膜中部，室温下放置5min，DNA样品置-20℃冰箱保存；
D、待测产品PCR扩增试剂SYBR®Premix Ex Taq II中加入PCR 上、下游引物、ROX参考染料ROX Reference Dye、DNA样品和双蒸水ddH2O，变形处理为 95℃预变性处理30s、95℃变性处理5s、℃退火处理34s，变形处理循环30-40次；
E、PCR扩增灵敏度及扩增效率检测检测待测产品的Cyt b引物扩增的灵敏度及Cyt b和β-actin引物的扩增效率，通过步骤B定量检测标准曲线模型计算得出检测肉制品猪源性成分含量，实现定量检测肉制品猪源性成分。
[0014]还包括步骤F、定量检测标准曲线模型检测：牛、羊、鸡和鸭肉样品按1:1:1:1混合后，混合样品中添加猪肉样品，猪肉样品添加比例为0、5、35、55和75%，试剂SYBR®Premix Ex Taq II中加入PCR 上、下游引物、ROX参考染料ROX Reference Dye、DNA样品和双蒸水ddH2O，调整DNA样品浓度为50ng /μL，变形处理为 95℃预变性处理30s、95℃变性处理5s、℃退火处理34s，变形处理循环40次，以β-actin为内参，不同添加比例的猪肉样品为对照，采用相对定量法计算DDCT法及2-DDCt值，检测步骤B的曲线模型。[0015]优选的所述步骤D中变形处理为 95℃预变性处理30s、95℃变性处理5s、℃退火处理34s，变形处理循环40次。所述步骤C中选用TIANGEN组织基因组DNA提取试剂盒，型号DP304。
[0016]以超市采集市售的部分品牌火腿肠（样品信息见表1），提取DNA, 按上述所述反应条件进行Real-time PCR检测，检测是否含有猪源性成分，并计算其含量进行详细分析。[0017]（1）Real-time PCR反应检测猪源性成分的特异性
提取的猪、牛、羊、鸡和鸭肌肉组织DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰、完整（图1），可用于PCR扩增。
[0018]在优化的Real-time PCR反应体系及条件下，对猪、牛、羊、鸡和鸭的Cyt b基因进行了Real-time PCR检测。如图2所示，在Real-time PCR扩增中，猪肌肉样品在16个循环后即进入指数扩增期，而牛、羊、鸡和鸭肌肉样品则出现在30个循环后，其Ct值均大于32，检测到的荧光强度极弱，应为假阳性，说明所设计的引物具有物种特异性。
[0019]设计特异性扩增猪DNA的PCR引物是检测猪源性成分的前提条件，因此通过分析比对猪与其他畜禽线粒体细胞色素b基因DNA序列，以其变异区域为模板设计引物序列，经
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Real-time PCR扩增，猪肌肉样品DNA 检测到较强的荧光强度，即Ct值低；虽然牛、羊、鸡和鸭肌肉样品DNA也检测到极弱的荧光强度，但其Ct值＞30，高于或接近无动物源性成分的空白对照。在理论上，空白对照及无猪源性成分样品DNA扩增时不会产生荧光信号，但实际操作中，往往由于仪器、试剂、引物及镁离子浓度等原因，即使严格控制DNA模板不受污染，也均在30循环后出现扩增曲线，应为假阳性，说明所设计的引物具有较好的物种特异性。[0020]（2）Real-time PCR扩增猪源性成分的灵敏度及扩增效率
为了检测Cyt b引物扩增的灵敏性，对浓度分别为5×10-4-50ng/μL的猪DNA进行了Real-time PCR反应。如图3所示，当反应物DNA浓度低至5×10-5 ng/μL时，反应仍然清楚地进入指数期扩增，并早于空白对照，因此，本方法检测低限可达5×10-5 ng/μL。
[0021]鉴于实际工作中由于食品加工等原因极有可能存在DNA提取量过低的问题及对清真食品的要求，需要检测方法有很高的灵敏度。以普通PCR方法检测熟肉制品，检测的灵敏度仅为 5 %，而采用实时PCR方法，检测牛、羊肉制品中掺杂猪源性成分的检测限可达1×10-6ng/ μL。本试验中，将猪DNA倍比稀释，分析其DNA最低检测量。当DNA浓度低至5×10-5
ng/μL时，扩增曲线仍然完整、清晰，Ct值高于空白对照，说明该方法有较高的灵敏度。[0022]在该DNA稀释浓度下，测定Cyt b和β-actin引物扩增的Ct值，以DCt（Ct β-actin- Ct Cyt b）为纵坐标、模板DNA浓度的对数为横坐标作图（图4），其斜率的绝对值为0.0769，接近于0，即Cyt b和β-actin引物的扩增效率基本一致，可以采用2-DDCt法计算Cyt b的相对量。[0023]（3）标准曲线的制作
以猪源性成分含量为 0-100%的混合肉样DNA为模板，进行Real-time PCR反应。以β-actin为内参，以无猪源性成分样品为对照，分析猪源性成分含量与Cyt b基因Ct值、DCt值、-DDCt及2-DDCt值之间的相关性（表2）。结果表明，利用2-DDCt法计算的相对定量值与猪源性成分的百分含量显著相关，利用Excel模拟出标准曲线（图5），回归公式为：y = 3075.5x + 160.83（y: 2-DDCt值，x:猪源性成分百分含量，R² = 0.9914）。[0024]已建立的动物源性成分PCR检测方法主要为定性检测，而肉制品中肉的实际含量以及掺假食品中掺假量也是消费者关注的问题。为此，我们采用实时荧光PCR相对定量法通过制作标准曲线，建立检测猪源性成分含量的方法。以猪源性成分含量已知的混合肉样DNA为模板，以β-actin基因为内参，检测Cyt b基因，建立定量分析的标准曲线，结果显示2-DDCt值与混合肉样中猪源性成分的含量有显著的线性关系（R² = 0.9914）。以猪源性成分含量不同的混合肉样DNA对标准曲线进行了验证，检测值与实际含量符合程度高，回收率达99.85-102.60%，在一般允许范围内。选择合适的内参基因对目的基因标准化，消除样品组成不均一性、DNA提取过程、提取批次等对DNA提取量、取样量的影响，从而使扩增曲线和检测结果更为可靠。本试验中，将猪肉组织与其他动物组织按比例混合，以2-DDCt值制作标准曲线，以排除实际检测中由于样品组成复杂而可能对扩增造成的影响。[0025]现有的食品中猪源性成分检测方法中，认为Ct值限定在35循环以内，在检测的特异性、灵敏性和假阳性控制方面均可达到较好的效果。然而，也有将Ct值检测阳性限定为30循环，与此类似，我们对牛、羊、鸡和鸭等无猪源性成分肌肉样品DNA检测实验中，常会检测到微弱的荧光信号，虽然扩增循环数或Ct值高于或接近空白对照，但仍有较完整的扩增曲线，在实际工作中会给是否含有猪源性成分的准确定性判断带来干扰；如果结合定量分析，用无物种特异性扩增的内参基因Ct值对目的基因标准化，并与无猪源性成分的对照组比较
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（如表3、4所示），则可排除“假阳性”，增强定性判断的可靠性。[0026]（4）标准曲线验证
制备猪源性成分含量分别为0%、5%、35%、55%和75%的混合肉样DNA，进行Real-time PCR反应，将所测2-DDCt值带入标准曲线中计算猪源性成分含量，以检验标准曲线及定量测定的准确性。由表3可见，检测的猪源性成分含量与实际值符合程度较高，回收率为99.85-102.60%。[0027]（5）部分市售火腿肠检测结果
对采取的6种市售火腿肠样品提取DNA，利用建立的Real-time PCR反应体系检测其猪源性成分，检测结果如图7和表4所示。标示为非清真的火腿肠中Cyt b基因Ct均值为21.94，其猪源性成分含量为12.7%，其余标示为清真食品的样品Cyt b基因Ct均值均大于30，高于或接近无猪源性成分的对照，应为无猪源性成分，定量分析显示为负值。[0028]表1抽检的市售火腿肠及其标注信息
表3猪源性成分含量检测验证结果
表4 市售火腿肠猪源性成分检测结果
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注：猪源性成分含量检测结果负值者应为检测阴性，即不含猪源性成分。
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