许蒙;陈锡玮;胡昌华
【摘 要】真菌非核糖体肽(nonribosomal peptides,NRPs)是一类重要的次级代谢产物,其中不乏结构和功能特殊、可作药用的化合物.本文介绍了组成非核糖体合成酶(nonribosomal peptide synthases,NRPSs)各结构域的功能,综述了已有报道的两种单模块非核糖体合成酶,即仅含有腺苷化结构域(adenylation domain,A结构域)、巯基化结构域(thiolation domain,T结构域)、硫酯酶结构域(thioesterase domain,TE结构域)的NRPSs:A-T-TE和仅含有腺苷化结构域、巯基化结构域、一个还原酶结构域(reductase domain,R结构域)的NRPSs:A-T-R的生物合成产物,并结合生物信息学分析推测了第3种含有腺苷化结构域、巯基化结构域、两个还原酶结构域的单模块NRPSs:A-T-R-R可能合成的产物结构. 【期刊名称】《中国抗生素杂志》 【年(卷),期】2018(043)006 【总页数】9页(P5-653)
【关键词】真菌;次级代谢产物;结构域;单模块NRPSs 【作 者】许蒙;陈锡玮;胡昌华
【作者单位】西南大学药学院重庆药物过程与质量控制工程技术中心,重庆400715;西南大学药学院重庆药物过程与质量控制工程技术中心,重庆400715;西南大学药学院重庆药物过程与质量控制工程技术中心,重庆400715 【正文语种】中 文
【中图分类】R9;Q559
微生物来源的天然产物在数量上仅次于植物来源的天然产物。在新药开发方式从化学合成转向生物合成的行业背景下，微生物以其具有易操作、生长迅速等特点，使其天然产物相较于植物来说更具开发价值[1]。微生物天然产物通常根据其生物合成途径被分为萜类、聚酮类、非核糖体多肽类和生物碱类[2]。非核糖体肽(nonribosomal peptides, NRPs)是由非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthases,NRPSs)催化，不经由核糖体途径合成的结构复杂种类繁多的多肽类小分子量化合物[3]。
NRPSs是一类多功能蛋白复合体，能识别、激活转运氨基酸底物按特定顺序合成NRPs[4]。NRPSs由相互的模块串联而成，每一个模块负责向多肽产物上连接一个氨基酸，常规NRPSs模块化的装配方式和线性结构决定了每个模块与最终产物中聚肽骨架的结构单元是一一对应的[4-5]。单模块的NRPSs仅具有一个A-T-C模块，且通常会有功能域的缺失；多模块的NRPSs存在重复的A-T-C模块。多模块NRPSs所合成化合物分子量通常较单模块NRPSs所合成的化合物分子量更大；因其多种多样的组合方式，它所合成的分子结构也更加丰富多样。相较于大多数多模块的NRPSs而言，单/双模块的NRPSs有着更古老的起源、更为保守的结构域、更为稳定的结构，其结构域不仅在真菌中有很高的保守性且与细菌中NRPSs结构域更为相近[6]。虽然并不排除单模块NRPSs与其他酶协同作用的可能，但单模块NRPSs依旧相对简单，更适合作为对NRPSs酶类研究的切入点。几组单/双模块的NRPSs产物相较于多模块的NRPSs而言它们在细胞的代谢及存活中起着更为关键的作用[6]。例如，土曲霉中的Asp-melanin能够保证土曲霉不受到紫外线的伤害以及土壤阿米巴原虫的吞噬[7]。本文主要关注单模块NRPSs的研究进展。
1 非核糖体肽合成酶(NRPSs)各结构域功能介绍
NRPSs的各个模块由不同的功能域构成，每个功能域有各自不同的催化功能，例如：底物的识别、装载，肽键的形成，产物的解离等[5]。一个基本的模块通常包括3个催化结构域：缩合结构域(condensation domain, C结构域)、腺苷化结构域(adenylation domain,A结构域)、巯基化结构域/肽酰载体蛋白(thiolation domain, T结构域/peptidyl carrier protein, PCP)，但是单模块NRPSs通常缺失C结构域[8]。
C结构域通常在模块的氮端，约450个氨基酸，通常情况下它催化形成两个底物之间的酰胺键，缩合域将氨基酸或多肽从上游载体蛋白结构域转移到先前被加载到下游T的底物的氨基部分上，当C结构域为起始结构域时通常会有一个不与T结合的底物被利用起来。C结构域属于氯霉素乙酰转移酶超家族，该家族都含有HHXXXDG功能区[9]。在氯霉素乙酰转移酶中这个功能区中第二个组氨酸负责从氯霉素中提取一个质子促进亲核攻击进而导致酰基的转移，C结构域的作用应该与此相似[10]。C结构域反应机制如图1所示。
T结构域是NRPSs中最小的结构域，由70～90个氨基酸组成。T结构域蛋白结构与反应机制如图2所示。非核糖体肽合成基因簇中通常伴随有一个磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(phosphopantetheine transferase, PPTase)基因。PPTase通过将硫酸巯基乙胺(phosphopantetheine, PP)活化T结构域，这一翻译后修饰将apo状态的载体蛋白转化为可与底物结合的holo状态的载体蛋白[11]。巯基化结构域中含有一个保守的丝氨酸位点，它是辅因子泛酰巯基乙胺与T结构域共价结合的结合位点。活化后，T结构域上的巯基通过一个氨基酸的羧基酯键共价结合氨基酸或肽底物，底物与磷酸巯基乙胺臂结合后应能与C结构域的活性位点结合[8]。 A结构域通常在模块的碳端，约500个氨基酸，它负责底物的活化和装载两个步骤的反应，属于腺苷酸合成酶家族。从A结构域的三级结构来看，它由一大一小
两个部分组成，其活性位点在两个部分间的连接处[8]。A结构域识别特定的氨基酸，在ATP的作用下合成相应的氨酰-AMP而使氨基酸底物得到活化，酰胺-AMP与T结构域上的辅因子磷酸泛酰巯基乙胺(4-phos-phopantetheine, Ppant)的巯基结合形成氨酰-S-载体复合物[11]。A结构域反应机制如图3所示。 除了上述3个结构域之外，NRPSs还具有其他结构域：硫酯酶结构域
(thioesterase domain, TE结构域)、差向异构酶结构域(epimerization domain, E结构域)、N-甲基转移酶结构域(N-methylation domain, M结构域)、还原酶结构域(reductase domain, R结构域)[8]。TE结构域通常存在于整个NRPS的最后，它作为水解酶或环化酶负责产物的解离产生链状或内酯及内酰胺的环化产物[12]。TE结构域约由300个氨基酸组成，它的一个丝氨酸残基与底物结合形成一个酰基酶中间体，在水作为亲核试剂的情况下水解产生链状化合物或者成环[13]。E结构域目前有两种：一种是将底物由L构型转化为D构型；一种将底物由D构型转化为L构型。E结构域通常在T结构域与C结构域之间，由约450个氨基酸组成。M结构域能在肽键的氮原子上加上一个甲基，从而赋予了肽键更多的稳定性。M结构域通常位于C结构域与A结构域之间，由约420个氨基酸组成。R结构域通常存在于无TE结构域的NRPSs末端，负责产物的释放，一般会得到碳原子端的醇或者醛，而不会得到羧酸。R结构域与短链脱氢酶同源性较高，约由280个氨基酸组成[14]。
图1 C结构域反应机制Fig. 1 Reaction catalyzad by the NRPS condensation domain
图2 T结构域蛋白结构及反应机制Fig. 2 Reaction catalyzad by the NRPS thioesterase domain
图3 A结构域反应机制Fig. 3 Reaction catalyzad by the NRPS adenylation domain
2 NRPS：A-T-TE型蛋白合成产物研究
构巢曲霉(Aspergillus nidulans)是目前被研究得较多的真菌之一，它所产生的次级代谢产物terrequinone A具有抗肿瘤的功效。Terrequinone A的生物合成路径中涉及到5个蛋白(TdiA～TdiE)，其中负责母核结构合成的TdiA，为A-T-TE型单模块的NRPS。如图4所示，色氨酸由TdiD转化为吲哚丙酮酸(indole pyruvic acid, IPA)，在TdiA的作用下两分子的IPA反应生成中间产物
didemethylasterriquinone D,didemethylasterriquinone D在一系列后修饰的作用下合成terrequinone A[15]。但TdiA并不是构巢曲霉中唯一的单模块NRPS，基因组分析显示该基因组有14个编码单模块NRPS的基因。通过更换原有启动子的方式对其他13个基因进行激活，其中的12个基因在此操作后对构巢曲霉次级代谢产物的产生并未产生影响，但基因AN3396.4的激活导致
microperfuranone的产量提高了，后续在黑曲霉(Aspergillus niger)中的异源表达实验证明AN3396.4是负责microperfuranone合成的唯一基因[16]。Microperfuranone具有抗菌活性，对大肠埃希菌(Escherich coli)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、黄瓜萎蔫病菌(Plectosphaerella cucumerina)、细极链格孢菌(Alternaria tenuissime PH30016)、青48(Fusarium flocciferum PH30048)的最低抑菌浓度分别为512、256、128、和128μg/mL[17]。 图4 Terrequinone A合成路线图Fig. 4 Biosynthetic pathway of terrequinone A
图5 Aspulvinone、butyrolactone IIa、phenguignardic acid及化合物1结构式Fig. 5 Chemical structure of aspulvinone, butyrolactone IIa, phenguignardic acid and compound 1
土曲霉(Aspergillus terreus)的基因组分析显示，它包含15个编码单模块NRPS的基因，其中5个已被研究的基因编码的蛋白：AtqA、ApvA、BtyA、AtmelA
和PgnA属于A-T-TE结构类型。AtqA、ApvA和AtmelA合成aspulvinone E；BtyA合成butyrolactone IIa；PgnA合成phenguignardic acid[7,18-20]。各化合物结构如图5所示。将pgnA克隆到构巢曲霉中表达的结果表明pgnA是负责合成phenguignardic acid的唯一基因[19]。Phenguignardic acid具有抗菌活性、细胞毒性且为一个植物性毒素[21-22]。apvA和atmelA分别位于土曲霉的III、IV号染色体上，异源表达的结果表明他们合成相同的化合物。ApvA和AtmelA分别在土曲霉的菌丝和孢子中表达合成aspulvinone E，继而在菌丝中合成aspulvinone类化合物，与此同时在分生孢子中合成黑色素，这种差异可能是由于他们自身启动子的不同造成的[18]。AtmelA和TyrP在产孢条件下共表达，AtmelA由TyrP(酪氨酸酶)活化后合成aspulvinone E，aspulvinone E自发的合成黑色素aspmelanin。Asp-melanin能够保证土曲霉的分子受到紫外线的伤害以及土壤阿米巴原虫的吞噬，且aspmelanin不抑制溶酶体的酸化，这可能使得土曲霉的孢子能在酸性的环境条件下生存[7]。以aspulvinone E和butyrolactone IIa为母核结构合成的丁酰内酯类化合物大多具有抗菌活性和细胞毒性，
aspulvinone类化合物还是荧光素酶抑制剂，特别值得一提的是isoaspulvinone E具有抗甲型H1N1流感病毒活性[23-25]。上述5个NRPSs所识别的底物均不是氨基酸而是α-酮酸，这应该是NRPS中A结构域识别活化特异性底物的结果。通过在构巢曲霉中异源表达，对apvA、btyA和pgnA的分析表明，将apvA的A结构域替换到btyA中A结构域的区域及将apvA的A-T结构域替换到btyA中A-T结构域的区域中均能得到butyrolactone IIa；将pgnA的A结构域替换到btyA中A结构域的区域及将pgnA的A-T结构域替换到btyA中A-T结构域的区域中均能得到新的化合物1。这表明底物的识别是由A结构域完成的，二聚过程中五元环的成环方式是由TE结构域决定的，此研究为在真菌中定向合成NRPs化合物提供了参考[20]。
在Tapinella panuoides中合成黑毛桩菇霉素(atromentin)的基因簇中含有一个关键的基因atrA。酪氨酸首先在磷酸吡哆醛(PLP)依赖的转氨酶AtrD的作用下转化为对羟基苯丙酮酸，两分子对羟基苯丙酮酸在AtrA的催化下合成黑毛桩菇霉素，如图6所示[26]。通过序列比对Serpula lacrymans中NPS3和Tapinella panuoides中AtrA与厚环黏盖牛肝菌(Suillus grevillei)中GreA相似度分别为81%和79%，NPS3和GreA同样能将酪氨酸转化为黑毛桩菇霉素，这表明NRPS：A-T-TE型的蛋白以芳香α-酮酸为底物的现象是广泛存在的、可作为类似基因簇和成产物结构推测的依据[27]。黑毛桩菇霉素是一种具有广泛生物活性的天然色素，可做抗凝血剂、平滑肌兴奋剂、肺炎链球菌烯酰-ACP还原酶的抑制剂，并能诱导人白血病U937细胞凋亡[28-31]。
图6 黑毛桩菇霉素合成路线图Fig. 6 Biosynthetic pathway of atromentin 综上所述，NRPS：A-T-TE型的蛋白以芳香族α-酮酸为底物，两分子底物聚合生成二聚体，见表1。
3 NRPS：A-T-R型蛋白合成产物研究
烟曲霉(Aspergillus fumigatus)对人类是一种条件致病菌，基因组分析确定其中有很多的单模块NRPs基因。它所产生的次级代谢产物烟曲霉素既具抗生素活性，又有抑制血管生成作用，从而具有抑制肿瘤生长的作用。最近的研究表明烟曲霉中有一个基因簇fsq含有一个编码NRPS：A-T-R型蛋白的基因fsqF。该基因簇所编码的酶以丝氨酸和苯丙氨酸(或酪氨酸)为底物合成一类名为fumisoquin与植物中次级代谢产物相似的异喹啉生物碱，这是一种新的次级代谢产物合成模式[32]。 在梅花状青霉(Penicillium herquei)的基因组中同样发现了编码NRPS：A-T-R型蛋白的基因hqlA，它负责herquline A生物合成过程中母核结构的合成。HqlA以酪氨酸为底物将其还原为相应的醛，之后两分子的醛脱水缩合成含有哌嗪对二氮环的化合物2(化合物2在自然条件下会被氧化成化合物3)，化合物2在同基因簇
中hqlB-F的作用下最终合成herquline A[33]。Herquline A具有抗流感病毒活性[34]。
表1 A-T-TE型NRPSs作用底物及中间产物汇总Tab. 1 A-T-TE type NRPSs' substrate and intermediates菌株 基因 底物 中间产物A. nidulans tdiA O OH O NH OH NH O O OH NH OH OH AN_3396.4 A. terreus melA/apvA/atqA OH O O O O OH OH O O O O OH O O OH OH btyA OH O O OH OH OO OH OH pgnA T. panuoides atrA S.lacrymans nps3 OH OH O O O O OHO OHO OHO OH OH OH O O OH O O OH OH OO OH OH O O OH OHOH OH S.grevillei greA OH O OH O OH
玉米条件致病菌黄曲霉(Aspergillus flavus)的基因组中存在两个同源性为58%的基因lnaA和lnbA(分别位于lna和lnb基因簇中)，它们所编码的蛋白均为NRPS：A-T-R型。LnaA和LnbA均以酪氨酸为底物并将其还原为相应的醛，两分子的醛聚合形成中间体，之后在其他后修饰酶的作用下合成化合物3、4和5[35]。化合物2～5、herquline A的结构式如图7所示。
在Stachybotrys bisbyi PYH05-7中存在LL-Z1272 β合成的基因簇，其中含有一个NRPS：A-T-R型的蛋白StbB。苔色酸在异戊烯基转移酶作用下转化为灰叶酸，StbB将灰叶酸芳环上的羧基还原为醛基，即得到LL-Z1272β[35]。LL-Z1272β结构如图7所示，它能选择性抑制对苯二酚氧化酶，对人体细胞毒性小，可作为先导化合物开发新型的抗病原菌及非洲锥虫病的化疗药物[37]。 在土曲霉(Aspergillus terreus)中也存在编码NRPS：A-T-R结构的基因ATEG_03630，它所编码的蛋白质以5-甲基苔色酸为底物将其苯环上的羧基还原为醛基[38]。对ATEG_03630所编码蛋白中A结构域进行突变以改变其底物识别的特异性，由此产生的H358A突变对邻氨基苯甲酸的活性增加10.9倍，这一实验结果可以指导我们对其他蛋白中的A结构域进行改造[39]。
图7 化合物2～5、herquline A和LL-Z1272 β结构式Fig. 7 Chemical structure of compound 2～5, herquline A and LL-Z1272β
表2 A-T-R型NRPSs作用底物及中间产物汇总Tab. 2 A-T-R type NRPSs' substrate and intermediates菌株 基因 底物 中间产物H2N O H2N O P. herquei hqlA OH OH OH H A. fl avus lnaA/lnbA OH H2N O OH OH H2N O H HO HO S. bisbyi PYH05-7 stbB OH COOH OH CHO HO HO A. terreus ATEG_03630 OH COOH OH CHO
目前研究到的NRPS：A-T-R以酪氨酸、苔色酸及苔色酸的衍生物为底物，将底物中的羧基还原为醛基，总结在表2中(FsqF在与其他酶的共同作用下完成了fumisoquin类化合物母核结构的合成，故未总结在表2中)。 4 NRPS：A-T-R-R可能的产物预测
除目前已有报道的NRPS：A-T-TE和NRPS：A-T-R两种单模块NRPSs外，我们根据各结构域的功能，以及单模块NRPSs缺失C结构域的规律推断还存在第3种类型的单模块NRPSs—NRPS：A-T-R-R。
经过基因组分析后发现本实验室的几株真菌中含有编码NRPS：A-T-R-R型蛋白基因，同时在NCBI下载到了上文中提到的大部分基因序列，分析得到各基因中A结构域氨基酸序列，利用MEGA 6.06软件做进化树分析得到结果如图8所示。 由图8结果分析，NRPS：A-T-TE型蛋白之间相对保守，这些A的差异性不超过0.6，且他们均以芳香丙酮酸为底物，10个蛋白中有7个以对羟基苯丙酮酸为底物，2个蛋白以苯丙酮酸为底物，而TdiA较为特殊以吲哚丙酮酸为底物。但从图7可以看出TdiA中A结构域与其他的分析样品之间的差异性并不是最大，由此可以推断A结构域识别底物的关键点并不是芳香环，芳香环的存在可能使得带电中间体更为稳定，而α-酮酸部分是两分子底物聚合反应的主要反应部位。
NRPS：A-T-R型蛋白之间的差异性较大，所识别的底物差异性也较大。其中A.
flavus LnaA和LnbA所识别底物均为酪氨酸，S. bisbyi StbB和A. terreus ATEG_03630所表达蛋白的底物分别为灰叶酸及5-甲基苔色酸，这3种底物中均含有苯环，但区别在于S. bisbyi StbB和A. terreus ATEG_03630所表达蛋白所还原的是与苯环相连的羧基。NRPS：A-T-R型蛋白催化芳酸到芳醛可能广泛的存在于真菌的次级代谢产物合成过程中[38]。
R结构域通常起到还原的作用，故推断A-T-R-R型所合成的母核结构应该并不是底物的二聚体。从图7可以看出A-T-R-R型蛋白中A结构域的同源性非常的高，高于A-T-TE型蛋白，尤其是P. griseofulvum、P. thymicola和P. citrinum 3株青霉菌中的相应A结构域相似度最高，因此它们很可能识别同一底物。它们与A. flavus LnaA和LnbA的相似性相对较高，若这些A所识别的底物为基本氨基酸，那么很有可能是酪氨酸。R结构域负责产物的释放时通常会得到醛或者醇而不会得到羧酸，那么我们可以由此推断NRPS：A-T-R-R结构中多出的一个R结构域会将醛进一步还原成相应的醇，即酪氨醇。若NRPS：A-T-R-R以芳香族α-酮酸为底物，那么经两次还原后可能得到芳香族α-羟基醛或α-酮醇。也不排除NRPS：A-T-R-R型蛋白以其他小分子化合物为底物或与其他蛋白共同作用的可能性，故它依然有可能产生未报道的化合物。
图8 各单模块NRPSs A结构域的进化树分析Fig. 8 Phylogenetic tree analysis of single module NRPSs' A domain 5 展望
近年来，随着基因组测序技术的发展，我们对真菌中合成次级代谢产物的基因簇有了更多的认识。在常规的培养状态下，真菌的大部分次级代谢产物合成基因簇都处于“沉默”状态，对这些沉默基因簇的激活成为了目前真菌次级代谢产物研究新的挑战和机遇。目前我们通过转录策略和异源表达策略来对其进行研究，真菌大片段基因簇克隆技术的发展和真菌表达系统(例如：酵母系统、构巢曲霉系统)的建
立为这些沉默基因簇的激活提供了先决条件。
真菌NRPSs合成了众多的次级代谢产物，NRPSs与其所合成的化合物结构一样多种多样。虽然单模块NRPSs类型相对较少，单模块非核糖体合成酶结构也相对简单，但其所合成的化合物却不乏研究价值。前文中所提到的单模块NRPSs所合成的小分子化合物，几乎都具有生物活性，其中一些甚至有着显著的药用价值，例如具有抗甲型H1N1流感病毒活性的isoaspulvinone E。我们期待能从对单模块NRPs产物中发现更具药效的化合物。单模块非核糖体合成酶较为简单的结构，使得对其研究更具有可操作性，本文中也有同类型单模块NRPS功能域互换成功产生新化合物的例子。目前已知的单模块NRPSs产物依旧相对较少，还有很多的编码单模块NRPSs的基因未被激活，期待这些未被激活的基因在将来带给我们惊喜。对单模块非核糖体合成酶的研究，能为我们对更为复杂的多模块非核糖体肽合成酶的研究提供参考。越来越多的反应机制被阐明，为最终应用组合生物合成人们需要的化合物奠定了基础。 参 考 文 献
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