亲和⾊谱分离分离的研究进展
亲和⾊谱的研究进展
学院：制药与⽣物⼯程专业：⽣物化⼯姓名：张妍学号：2012255
摘要：亲和⾊谱是利⽤⽣物分⼦，特别是⽣物⼤分⼦与亲和⾊谱固定相表⾯配位体之间，存在的⽣物学与⽣物化学过程的特效性亲和吸附作⽤，来进⾏选择性分离⽣物分⼦的分离⽅法。亲和⾊谱具有⾼选择、⾼活性回收率和⾼纯度等特点，⾄今已在⽣物化学、分⼦⽣物学、基因组学、蛋⽩质组学、⽣物⼯程、临床医学、新型⾼效药物研究中已成为分离纯化最有效的技术之⼀，是⽣物化⼯研究的重要⽅向。本⽂通过查阅⽂献综述了亲和⾊谱技术及其发展趋势。关键词：亲和⾊谱、配基、分离纯化、研究进展The research progress of affinitychromatography
Abstract：Affinity chromatography is a selective separation method which uses the effects of the existence of affinityadsorption in the biological and biochemical processes between biological molecules, particularly biological
macromolecules and ligand on the surface of the affinity chromatography stationary phase. Affinity chromatography with highselection, high recovery and high purity etc., it has been used in biochemistry, molecular biology, genomics, proteomics,biological engineering, clinical medicine and new high efficiency in drug research. And it has become one of most effectiveseparation and purification technology. This article introduced affinity chromatography simply and reviewed and itsdevelopment trend.
Keywords:Affinity chromatography, ligand, separation, development trend⼀、概述
（⼀）、亲和⾊谱基本概念
亲和⾊谱是⼀种利⽤固定相的结合特性来分离分⼦的⾊谱⽅法。亲和⾊谱在凝胶过滤⾊谱柱上连接与待分离的物质有⼀定结合能⼒的分⼦，涉及分⼦间的范德华⼒、疏⽔作⽤⼒、静电吸引⼒、络合作⽤⼒以及空间位阻效应等作⽤⼒因素，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时⼆者还能相互分离。亲和⾊谱可以⽤来从混合物中纯化或浓缩某⼀分⼦，也可以⽤来去处或减少混合物中某⼀分⼦的含量。亲和⾊谱分离的通常是混合在溶液中的物质，⽐如细胞内容物、培养基或⾎浆等。待分离的分⼦在通过⾊谱柱时被固定相或介质上的基团捕获，⽽溶液中其他的物质可以顺利通过⾊谱柱。然后把固态的基质取出后洗脱，⽬标分⼦即刻被洗脱下来。
（⼆）、亲和⾊谱法的基本过程是：
1)配基固相化。将与纯化对象有专⼀结合作⽤的物质，连接在⽔不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱。
2)亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出⾊谱柱。
3)解吸附。⽤某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质
洗脱出来。如果分离的⽬的是去除溶液中某种分⼦，那么只要分⼦能与介质结合即可，可以不必进⾏洗脱。（三）、亲和⾊谱的分类
⾃20世纪50年代⾄今，亲和⾊谱法已获得巨⼤的发展，依据亲和⾊谱固定相键和配位体的不同，可将亲和⾊谱⽅法分为⽣物特效亲和⾊谱、染料配位亲和⾊谱法、定位⾦属离⼦亲和⾊谱法、包合配合物亲和⾊谱法、电荷转移亲和⾊谱法、共价亲和⾊谱法、印迹分⼦亲和⾊谱法和疏⽔作⽤亲和⾊谱法。由于其基体及配位体的不同其应⽤对象也各不相同。
其中，⽣物特效亲和⾊谱法主要⽤于⽣物活性物质，如肽、蛋⽩质、核苷酸、抗体、抗原、病毒和细胞碎⽚；染料配位亲和⾊谱法主要⽤于核碱、核苷、核苷酸、核酸与核酸键合的蛋⽩质、⽣物酶；定位⾦属离⼦亲和⾊谱法主要⽤于肽、蛋⽩质、核酸、⽣物酶；包合配合物亲和⾊谱法主要⽤于⼿性氨基酸、多肽、⽣物酶、纤维细胞⽣长因⼦、凝固因⼦、脂蛋⽩及多种⼿性药物；电荷转移亲和⾊谱法主要⽤于氨基酸、肽、蛋⽩质、核碱、核苷酸；共价亲和⾊谱法主要⽤于含硫多肽和蛋⽩质，含汞多聚核苷酸；印迹分⼦亲和⾊谱法主要⽤于氨基酸、肽、蛋⽩质、核苷酸、辅酶；疏⽔作⽤亲和⾊谱法主要⽤于不同蛋⽩质和核酸[1]。
（四）、影响亲和⾊谱的因素
1、上样体积
若⽬标产物与配基的结合作⽤较强，上样体积对亲和⾊谱效果影响较⼩。若⼆者间结合⼒较弱，样品浓度要⾼⼀些，上样量不要超过⾊谱柱载量5%-10%。2、柱长
亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。如果亲和介质的载量⾼，与⽬标产物的作⽤⼒强，可以选择较短的珠⼦；相反，则应该增加柱⼦的长度，保证⽬标产物与亲和介质有充分的作⽤时间。3、流速
亲和吸附时⽬标产物与配基之间达到结合反应平衡需要⼀个缓慢的过程。因此，样品上柱的流速应尽量的慢，保证⽬标产物与配基之间有充分的时间结合，尤其是⼆者间结合⼒弱和样品浓度过⾼时。4、温度
温度效应在亲和⾊谱中⽐较重要，亲和介质的吸附能⼒受温度影响，可以利⽤不同的温度进⾏吸附和洗脱。⼀般情况下亲和介质的吸附能⼒随温度的升⾼⽽下降，因此在上样时可选择较低的温度，使待分离物质与配基有较⼤的亲和⼒，充分地结合；⽽在洗脱时刻采⽤较⾼的温度，使待分离物质与配基的亲和⼒下降，便于待分离物质从配基上脱落。例如，⼀般选择在4℃进⾏吸附，25℃下进⾏洗脱。⼆、亲和⾊谱的发展历史
1910年，Starkenstein将蔗糖酶抗体吸附到⾼岭⼟上，研究了抗体和抗原的相互作⽤，并发现淀粉酶与不溶解淀粉键合得⼗分紧密[2]。
1924年，Engelhardt提出“固定配偶原理”作为分离⽣物活性物质的⽅法[3]。1933年，H olmtergh利⽤淀粉凝胶进⾏⾊谱分离从β-淀粉酶中分离出α-淀粉酶[4]。1951年，Camptell将抗原⽩蛋⽩固定在重氮基对氨基苄基纤维上，⽤以纯化抗体[5]。1953年，Lerman将偶氮染料固定在纤维素上，纯化蘑菇中的络氨酸酶。
1954年，Grubhofer,Schleith为应⽤⽬的，将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋⽩酶、核糖核酸酶固定在重氮化氨基聚苯⼄酰树脂上。1959年，Porath和Flodin将葡萄糖Sephadex基体引⼊亲和⾊谱中，使亲和⾊谱得到快速发展。1963年，Merrifield提出固相肽合成⽅法，为亲和⾊谱固定相制备提供了可借鉴的途径。19年，Hjerten研制出球形琼脂糖，它与葡聚糖都适⽤作亲和⾊谱的基体材质[7]。
1967年，Axen、Porth、Ernback提出⽤溴化氰活化琼脂糖的⽅法，为多肽、蛋⽩质在基体上固定化开辟了新的⽅法[8]。1968年，Cuatrecases和Wilchek定义亲和⾊谱的概念，扩展亲和配位体范围，包括酶、抗原（半抗原）、抗体、激素、维⽣素、外援凝集素、糖蛋⽩、膜蛋⽩、病毒、细胞等。确⽴了⽣物特效亲和⾊谱⽅法[9]。
1970年，Cuatrecasces进⼀步完善溴化氰活化琼脂糖的⽅法，并提出在固相基体和配位体之间插⼊“空间间隔壁”的概念和⽅法，成功的解决了配位体的⽴体可接受性问题，对亲和⾊谱的发展做出了突破贡献。
1972年，Yon提出利⽤在⽔溶液中，⾮极性官能团之间的接触组合，来分离蛋⽩质和核酸的硫⽔作⽤⾊谱⽅法；Wulff提出了印迹分⼦⾊谱法[10]。
1973年，Couper提供甲基丙烯酸⼄⼆醇聚酯载体Spheron;Brocklehurst提出⽤2—吡啶⼆硫化物作配位体的共价⾊谱法；Hayman⽤亲和⾊谱法分离细胞。
1974年，Epton提供聚丙烯酰吗啉载体Enzacryl；Easterday提出⽤三苯甲烷染料作配位体的染料配位⾊谱⽅法。1975年，Kristeinsen⽤亲和⾊谱法分离病毒。
1977年，Porath提出⽤2,4-⼆硝基苯作配位体的电荷转移⾊谱⽅法。
1978年，Porath提出⽤⾦属离⼦螯合物作配位体的定位⾦属离⼦亲和⾊谱⽅法；Ohlson提出以⼤孔微粒硅胶作载体的⾼效液相亲和⾊谱法。
1980年到1990年，β-CD、冠醚、⽳醚、杯芳烃、⼤环抗⽣素、⽤作亲和包合配位体，发展了包合配合物亲和⾊谱⽅法。Armstrong⾸先应⽤包合配合物亲和⾊谱⽅法。
1990年到2000年，新型载体获⼴泛应⽤，如灌注⾊谱固定相Poros；⽆极氧化物：ZrO2,，TiO2,CeO2,WO3
及杂化材料：ZrO2
-脲醛树脂复合微球[11]。
随着HPLC⾊谱柱制备技术的迅速发展，亲和⾊谱也应⽤了新型⾊谱柱；内壁键合三嗪染料的开管⽑细管亲和⾊谱柱；甲基丙烯酸缩⽔⽢油酯-⼆甲基丙烯酸亚⼄基脂作基体，键合⽣物特效配位体或燃料的整体柱；键合维⽣素的纳⽶芯⽚亲和⾊谱柱。三、亲和⾊谱国内外研究现状
膜亲和⾊谱是⼈们将亲和⾊谱和膜技术结合起来研制的，以膜为基质的亲和⾊谱，其基本原理是将微滤膜或超滤膜经表⾯改性活化处理后，偶联上合适的配基，使固定在膜载体上的配基特异性地与待分离的⽣物⼤分⼦结合成复合物，再经洗脱是⽣物⼤分⼦得以分离纯化。因此亲和膜⾊谱技术即具有膜技术分离快，处理量⼤的特点，⼜具有亲和⾊谱特异性⾼的优点。⽬前亲和膜⾊谱法已成为分离纯化⽣物⼤分⼦的重要⼿段之⼀。链接到膜基质上的配体分为两⼤类：⽣物特异性配体和基团特异性配体，后者⼜称为通⽤性配体。以此为依据，可以对膜亲和⾊谱法进⾏分类，常见的有⽣物亲和⾊谱，免疫亲和⾊谱，⾦属螯合亲和⾊谱等。
⽣物亲和⾊谱中连接到基质上的配体是存在特异性相互作⽤的⽣物⼤分⼦，如酶与底物，酶与抑制剂，激素与受体等，因⽽具有⾼度的选择性。但是这类⽣物⼤分⼦通常价格昂贵且不易连接到基质上，了它们在⼤规模⼯业⽣产中的应⽤。
免疫亲和⾊谱是将抗原抗体中的⼀⽅连接到基质上来吸附纯化另⼀⽅的⾊谱分离技术。随着可利⽤的单克隆抗体技术的发展，免疫亲和⾊谱的应⽤⽇益⼴泛，期⼯业化应⽤前景⼴阔。
⾦属螯合亲和⾊谱⼜称固定化⾦属螯合亲和⾊谱，是Porath等⾸先提出来的。在上世纪70年代他们将铜离⼦、锌离⼦通过螯合剂亚氨基⼆⼄酸交联到
Agatose上，利⽤⾦属离⼦与蛋⽩质表⾯组氨酸等的配位作⽤选择性的分离对⾦属离⼦有亲和⾥的蛋⽩质。期理论基础是不同条件下配位键的形成和解离，即过渡⾦属离⼦(铜，铁，锌，镍等)与蛋⽩质表⾯的组氨酸，⾊氨酸，半胱氨酸等电⼦供体形成配位复合物，因⽽连接上这些⾦属离⼦的载体就能选择性的吸附含有咪唑基或巯基的肽类或蛋⽩质。吸附⼒的⼤⼩在很⼤程度上取决于蛋⽩分⼦表⾯咪唑基或巯基的稠密程度。此外，不同的⾦属离⼦对亲和⼒⼤⼩也有影响。80年代，⼈们⼜提出⽤微孔的膜作⽀撑基质，充分发挥了膜过程设备简单，易放⼤，成本低，分离速度快，可连续操作等优点，是⽣物⼯程产品的⼯业化⼤规模分离纯化得以实现。
亲和⾊谱作为液相⾊谱的⼀个重要分⽀，对于⽣物⼤分⼦的分离纯化是有特殊意义的。如果说前⾯所介绍的⼏种⾊谱⽅法都是通⽤性分离技术的话，那么亲和⾊谱⽅法则基本上是属于专⼀性的，前者是根据溶质分⼦之间在物理化学性质⽅⾯的差异所建⽴的分离⽅法，后者则利⽤了⽣物分⼦之间特异性相互作⽤⽽实现分离的。这种特异性相互作⽤是活性⽣物⼤分⼦固有的特征，例如酶能与底物、抑制物、辅酶等结合，抗体能与互补的抗原相结合，凝集素能与细胞的表⾯抗原以及某些糖类相结合，激素能与蛋⽩及细胞受体形成复合物，基因可与核酸和阻遏蛋⽩相互作⽤等等。所以，原则上讲，如果在固相载体上连接⼀种具有⽣物特异性的配基，就可以建⽴⼀种亲和⾊谱⽅法，⽤于分离与配基相对应的物质。
有机⾼分⼦类型的AFC填料，按其基质材料，可分为多糖型和⾼聚物型两⼤类；按其配体性能即填料所携带配体对被分密物质的选择性特征，可分为专⽤性和通⽤性两⼤类。专⽤性填料，例如基于抗原与抗体、激素与受体蛋⽩等特异性相互作⽤的填料，其配体对于⽬标化合物有很⾼的特异选择性和亲和能⼒。通⽤性填料因其配体可与数种⽣物分⼦产⽣亲和作⽤，显然达不到专⼀的选择性，但这类配体的种类很多，价格低廉⽽容易获得，应⽤范围⾮常⼴泛，所以在亲和⾊谱中仍处于主导地位。常见的通⽤性亲和配体，要包括⾦属螫合配体（如螫合了Cu2+、Ni2+、Zn2+等⾦属离⼦的配体），⼩分⼦类配体（如氨基酸、肽类、明胶、肝素等），颜料类亲和配体，外源凝集素类亲和配体（如⼑⾖球蛋⽩、扁⾖外源凝集素、麦芽外源凝集素等）、核酸与核苷酸类亲和配体。
从亲和配体的连接⽅式来看，既可以将配体与基质直接偶联，也可以在基质与配体之间插⼊⼀如适当长度的链状间隔臂。⼤量研究表明带有间隔臂的AFC
填料往往具有更为优异的⾊谱性能，由于适当的间隔壁链段可以有效地克服基质表⾯的⼏何位阻效应，使得配体更容易与被分离物质相结合。对于以⼩分⼦为配体来分离⼤分⼦的亲和填料来说，间隔臂的作⽤就更为重要了。AFC填料的间隔臂按其结构类型，主要包括脂肪链的烃类、链状的聚胺类、肽类、链状聚醚类等。间隔臂有亲⽔性的，也有疏⽔性的，间隔臂链段长度则视其结构与性能不同⽽异，例如疏⽔性的脂肪烃类链段，⼀般为2~10个亚甲基的长度，过长会因其⾃⾝返折⽽失去作⽤，也会因其产⽣强疏⽔性吸附⽽对蛋⽩质的分离不利。
亲和⾊谱的显著特点是，具有其他分离技术所不能⽐拟的⾼选择性，⽽且能有效地保持⽣物⼤分⼦⾼级结构的稳定性，活性样品的回收率也⽐较⾼，所以这种技术⽤于纯化酶、抗体、核酸、辅助因⼦和各种能识别、贮存和运载具有⽣化和药理作⽤物质的蛋⽩质，⽤于⽣物样品解离常数和平衡常数以及动⼒学序列和结合机制的研究等，都是很有意义的。四、展望
亲和⾊谱经历40多年的发展，是具有锁-钥结构⽣物识别功能的亲和特性，受到越来越多的重视。⾄今，亲和⾊谱技术不仅在⽣物化学、分⼦⽣物学、代谢产物的临床分析、新药的研制等领域得到⼴泛的应⽤，并且在⽣物⼯程中，亲和制备⾊谱已成为制备⽣物活性物质，如核酸、蛋⽩质、胰岛素、⼲扰素、艾滋病疫苗的有效⼿段，他提供的⾼效、⽆污染的分离技术，蕴藏着巨⼤的商机[12,13]。
涉及⽣物⼤分⼦的⽣化分离，⾄今仍然存在诸多的问题，例如，⾸先在于不同种类的⽣物⼤分⼦，如核酸和蛋⽩质，由于它们在化学结构和存在形态上的巨⼤差异，难于建⽴有序的纯化规律，并现已使⽤的分离⽅法均未达到最优化的操作条件。其次在⽣化分离中涉及的⽣物⼤分⼦，分⼦量⾼达⼏万或⼏⼗万，仅具有低的热扩散能⼒，在制备过程和对最终产品的监测缺少简便、快速的⽅法，必须采⽤⾊谱-质谱联⽤技术才能实现[14,15]。参考⽂献：
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