维普资讯 http://www.cqvip.com Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ计算机工程与应用 一种光学显微自动聚焦系统设计与实现 易秋实，张红民，吴 萍，吕晓华，骆清铭，曾绍群 ＹＩ Ｑｉｕ—ｓｈｉ，ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ—ｒａｉｎ，ＷＵ Ｐｉｎｇ，ＬＶ Ｘｉａｏ—ｈｕａ，ＬＵＯ Ｑｉｎｇ—ｒｕｉｎｇ，ＺＥＮＧ Ｓｈａｏ—ｑｕｎ 华中科技大学生物医学光子学教育部重点实验室一武汉光电国家实验室，武汉４３００７４ Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ—Ｗｕｈａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７４，Ｃｈｉｎａ Ｅ—ｍａｉｌ：ｉｂｐ＠ｍａｉｌ．ｈｕｓｔ．ｅｄｕ．ｅｎ ＹＩ Ｑｉｕ—ｓｈｉ，ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｍｉｎ，ＷＵ Ｐｉｎｇ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌ ａｕｔｏ－ｆｏｃｕｓ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００７，４３（２７）：１１９－１２０． Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｏｐｔｉｃａｌ ａｕｔｏ—ｆｏｃｕｓ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ＰＣ ｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌｏｗ—ｃｏｎｔｒａｓｔ ｉｍａｇｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｎ— ｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＣＣＤ ｃａｍｅｒａ．Ｆｉｒｓｔｌｙ，ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｈａｆｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｎｄ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ａｘｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｉｃｒｏ—ｓｔｅｐ ｄｒｉｖｅｒ，ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｇｅａｒ ｗａｓ ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｆｏｃｕｓ ｗａｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｓｅｃｏｎｄｌｙ，ｉｔ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｕｔｏ－ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｉｓ ｏｎｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｌｏｗ—ｃｏｎｔｒａｓｔ ｉｍａｇｅ ｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｏｍｅ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｐｅｒａｔｏｒｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｈａｖｅ ｓｈｏｗｎ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏ— ｐｏｓｅｄ ｓｃｈｅｍｅ ｍｅｅｔｓ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｕｔｏ——ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｂｏｔｈ ｏｎ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ ｓｐｅｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ａｕｔｏ—ｆｏｃｕｓ；ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ｓｔｅｐｐｅｒ—ｍｏｔｏｒ；ａｕｔｏ—ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｐｅｒａｔｏｒ 摘要：针对普通ＣＣＤ拍摄的低对比度生物样品图像，设计并实现了一种以Ｐｃ机为控制核心的光学显微镜自动聚焦系统。系统 采用弹性联轴器与显微镜调焦轴直接耦合的方式，结合细分驱动，有效地消除了传动机构的回程差，提高了聚焦控制精度。在对几 种常用图像清晰度评价算子进行分析的基础上，证实了图像自相关算子是评价低对比度生物样品图像清晰度的有效算法。实验结 果表明，该系统自动聚焦的准确度和实时性基本上满足生物学研究的需要。 关键诃：自动聚焦；显微镜；步进电机；自相关算子 文章编号：１００２—８３３１（２００７）２７—０ｌ１９—０２ 文献标识码：Ａ 中图分类号：ＴＰ３０２．１；ＴＨ７４２ １引言 显微镜的自动聚焦控制广泛应用于生物学和医学研究中， 它可以提高实验与分析的速度，降低人为操作对显微成像质量 的影响…。显微镜自动聚焦技术主要包括精密运动控制和自动 聚焦分析两个方面。目前的显微镜的自动聚焦系统通常以Ｐｃ 机为控制核心，采用步进电机作为运动控制部件，选用ＣＣＤ器 件结合软件算法来进行聚焦分析和运动控制。文献［１］采用了步 进电机的８级细分驱动，并配备了２６２：１的微齿轮减速箱作为 运动控制部件，提高了分辨率；文献［２］开发了步进电机４级细 分驱动器来控制镜头的运动，实现了流水线上工件的连续图像 采集测量；文献［３］和［４］中比较了各种图像清晰度评价函数的优 劣，得到了适合各自系统的自动聚焦分析算法；文献ｆ５］采用了 微镜调焦轴直接耦合，较好地消除了传动机构的回程差。在比 较了几种图像清晰度评价算法性能的基础上，采用了图像自相 关算子作为图像清晰度评价方法，有效地达到了自动聚焦分析 的目的。 ２系统整体结构设计 光学显微自动聚焦系统以计算机为控制核心构建，采用上 下位机方式。上位机主要包括ＰＣ机、图像采集卡、ＣＣＤ相机 等，下位机主要包括微控制器、步进电机驱动器、传动装置、显 微镜、位置传感器等，系统框图如图１所示。工作过程如下： ＣＣＤ相机采集到显微图像后，经图像采集卡传入上位ＰＣ机 成本较高的数字ＣＣＤ相机作为图像采集部件，实现了自动聚 焦单元。但是，上述工作在机械运动控制精度以及图像清晰度 中。Ｐｃ机对显微图像进行清晰度自动分析后，将相应控制指令 通过ＲＳ２３２串口发送给下位微控制器，微控制器控制步进电 评价函数选取等方面仍有一定的不足之处［５１。 在生物医学应用中，通常采用性价比较高的普通黑白 ＣＣＤ相机拍摄图像，采集的样品图像对比度较低，显微自动聚 焦更为困难。为了提高运动控制的精度，简化机械设计，本文采 用了步进电机１２８级细分驱动控制器，并通过弹性联轴器与显 图１显微自动聚焦系统结构框图 基金项日：国家自然科学基金（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ ｕｎｄｅｒ Ｇｒａｎｔ Ｎｏ．６０４１０１３１，Ｎｏ．９０５０８００３）。 作者简介：易秋实（１９８２一），男，硕士研究生，主要研究方向：显微成像系统设计；曾绍群（１９６９一），通讯作者，男，博士，教授，博士生导师。 维普资讯 http://www.cqvip.com
１２０ ２００７。４３（２７） Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ计算机工程与应用 机动作，经传动装置驱动显微镜的调焦轴以实现自动聚焦。其 中位置传感器对显微镜物镜的运动起限位作用。 ４系统软件功能设计 显微自动聚焦软件实现依赖于两个核心的算法：自动搜索 算法和图像清晰度评价算法。前者自动控制显微镜物镜上下运 动，在最短时间内找到最佳聚焦平面，后者对ＣＣＤ采集到的图 像进行清晰度评价和自动分析，然后将分析结果换算成控制指 令发送给下位机，控制电机运动到最佳聚焦位置。 ３系统硬件结构设计 ３．１聚焦执行机构 系统采用普通两相双极型步进电机作为执行元件，基本步 距角为１．８。，显微镜为ＢＸ５１（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐ．，Ｊａｐａｎ）。实际测试 表明，当显微镜的粗调旋钮旋转３６０。时，显微镜物镜行程约 ４．１自动搜索算法 一个好的自动搜索算法要求能够决速准确地找到最佳聚 ２０ ｍｍ。为了消除机械传动机构的回程差，提高聚焦控制精度。 一焦平面，变步距自动搜索算法［６１（如图３所示）能较好地达到此 目的。算法描述如下： 方面，采用弹性联轴器实现了步进电机与显微镜调焦轴的直 接耦合。这样，电机每转动一个基本步距角，物镜在垂直方向上 移动约１００ ｕｍ。另一方面，考虑到生物医学实验时细胞胞体厚 度为１０ ｕｍ左右，因此需要对电机做细分驱动才能满足聚焦精 度的实验要求。设计时，对步进电机进行１２８级细分驱动，使得 每个微步距对应的物镜最小行程约为１ ｕｍ，聚焦执行机构的 分辨率达到了细胞显微成像的要求。同时，细分驱动方式有助 于电机长时问的平稳运行，减少噪声。 步进电机的细分驱动采用的是斩波恒流方式，驱动芯片采 用ＬＭＤ１８２４５Ｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ，ＵＳＡ）。该芯片可提供 高达３ Ａ的驱动电流，只需外接两个电阻和两个电容即可实现 电机的全桥驱动、数字电流控制、过流保护等功能，非常适合步 进电机的细分驱动。另外，为了克服该芯片内置的４ ｂｉｔ ＤＡＣ 只能实现最多１６级细分的缺点，直接采用了微控制器的两路 １２ ｂｉｔ ＤＡＣ来实现步进电机的１２８级细分驱动。 ３．２微控制器 微控制器采用Ｃ８０５１Ｆ系列ＳｏＣ单片机Ｃ８０５１Ｆ０２０（Ｓｉｌｉ— ｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ），负责步进电机的驱动控制、显微 镜物镜的限位、与上位机Ｐｃ通讯等。Ｃ８０５ １Ｆ系列单片机是完 全集成的混合信号系统级ＭＣＵ芯片，其内核为高速、流水线结 构，与８０５１完全兼容且集成了丰富的片上资源。以Ｃ８０５１Ｆ０２０ 单片机为核心的控制电路结构如图２所示： 图２基于Ｃ８０５１Ｆ０２０单片机的控制电路结构 ３．３传动与限位装置 步进电机与显微镜的耦合有齿轮箱、皮带等方式，但是存 在精度低、安装复杂、有回程差等缺点。因此，本文采用弹性联 轴器直接耦合电机与显微镜的调焦轴的方式，有效地消除了回 程差。虽然由于弹性联轴器没有变速比，需要电机提供更大的 扭转力矩。但是步进电机驱动芯片ＬＭＤ１８２４５Ｔ提供了高达３ Ａ 的驱动电流，完全可以满足驱动要求。 在显微镜调焦轴的上下运动过程中，如果没有限位装置， 显微镜的物镜很容易碰撞到载物台而划伤或破裂。设计中，采 用霍尔开关起限位作用，将其固定在物镜附近并随物镜垂直移 动，同时，在霍尔开关的投影位置放一个小磁钢。当物镜与载物 台的距离达到极限位置时，霍尔开关输出一个订Ｌ电平跳变， 控制器检测后发出指令停止电机移动。 ｐｐｅｒ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ １ 萋 ｆｏｃｕｔｓ１ Ｉ１） ｐ）萋 ｆｏＣｉｎＵｔＳ２ ●＝） １ ２ ３ ４ ５ 图３ 自动搜索算法示意图 （１）第一轮遍历：以大步距遍历整个聚焦行程。 （２）分析采集到的一系列图像，计算得到聚焦位置１，电机 驱动物镜运动到此处。 （３）电机驱动物镜反冲一定距离，为第二轮遍历做准备。 （４）第二轮遍历：以较小步距遍历聚焦位置１点的周围。 （５）分析采集到的一系列图像，计算得到聚焦位置２，电机 驱动物镜运动Ｎｌｌｔ￣。 （６）减小步距角，重复（３）～（５），直到步距角小于某个预设 值为止。 ４．２图像清晰度评价算法 图像清晰度评价算法的选取对自动聚焦的性能至关重要 ， 一般可分为空域和频域两类，常用的算法有灰度方差法１３１、灰度 梯度法１］１、能量谱法１３１、高频分量法『 等等。但频域类算法通常运 算量较大，需要硬件支持才能达到实时的目的，故空域类算法 往往成为首选方法，如采用灰度方差算子、灰度梯度算子等。但 是，灰度方差和梯度算子对细胞与背景灰度值差异大、胞体边 缘锐利的图像比较有效，采集该类图像需要选用价格较高的低 照度、高分辨率ＣＣＤ相机。这样，无疑会大大增加系统成本。 为检验灰度方差算子（以Ｖａｒ表示）和灰度梯度算子（以 Ｒｏｂｅ，ｓ为例）对于普通黑白ＣＣＤ拍摄的低分辨率、低对比度 图像的清晰度评价效果，在Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５ １正置显微镜上，用 黑白ＣＣＤ相机ＭＢＣ一５０５ １（ＡｉＲＯＮｉＸ Ｃｏｒｐ．，Ｊａｐａｎ）拍摄了整个 物镜行程中的一系列细胞图像（图４），其图像清晰度评价曲线 如图５所示。明显可以看出，Ｒｏｂｅｒｔｓ梯度算子的评价曲线出现 了较多局部极值点，基本上无法确定最佳清晰度位置，而灰度方 差Ｖａｒ算子的评价曲线虽然出现了较明显的单峰，但该曲线衰减 较熳且在最佳清晰度位置有少量伪峰出现，容易得出错误结果。 Ｉｍａｇｅ Ｎｏ．１ Ｉｍａｇｅ Ｎｏ．２１ Ｉｍａｇｅ Ｎｏ．３５ Ｉｍａｇｅ Ｎｏ．４５ 图４ ＣＣＤ拍摄的原始细胞图像 （下转２１５页） 维普资讯 http://www.cqvip.com 任春玉：电子商务下多约束有时间窗车辆问题优化研究 表５基于线路最短调度结果（２） ２００７，４３（２７） ２１５ 参考文献： ［１］Ｆｉｓｈｅｒ Ｍ Ｌ．Ｖｅｈｉｃｌｅ ｒｏｕｔｉｎｅ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ ｗｉｎｄｏｗｓ：ｔｗｏ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｌ— ｇｏｒｉｔｈｍｓ［Ｊ］．Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，４５（３）：４８８—４９２． ［２］Ｊｏｅ Ｌ，Ｒｏｖｅｒ Ｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｖｅｈｉｃｌｅ ｒｏｕｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ［Ｃ］／／Ｐｒｏｅｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｆｔｈ Ｉｎ— ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，１ ９９３：４５２—４５９． ［３］姜大立，杨西龙，杜文．车辆路径问题的遗传算法研究ｌＪｌ＿系统工程 理论与实践，１９９９，１９（６）：４０—４５． ［４］谢秉磊，李军，郭耀煌．有时间窗的非满载车辆调度问题的遗传算 法ｌ Ｊ１．系统工程学报，２０００，１５（３）：２９０—２９４． ５结论 通过实例验证，证明基于费用最小的多约束有时问窗车辆 调度模型，符合电子商务的实际需求，成本最低，而且能够满足 客户时间要求，取得较好的实际效果。 实例也说明改进的遗传算法具有局部最优和整体寻优性 能，大大提高优化质量。（收稿日期：２００７年１月） ［５】朱树人，李文彬，匡芳君．一种带软时间窗的物流配送路径优化遗传 算法ｌＪｌ＿计算机工程与科学，２００５，２７（１２）：１０８—１１０． ［６］蒋忠中，汪定伟．Ｂ２Ｃ电子商务中物流配送中心优化设计ｌＪ１．东北大 学学报：自然科学版，２００５，２６（８）：７２９—７３２． ［７］谢胜利，唐敏，董金祥．求解ＴＳＰ问题的一种改进的遗传算法ｌＪｌ＿计 算机工程与应用，２００２，３８（８）：５８—６０． ［８］龚延成，郭晓汾，尤晓铃，等．基于遗传算法的物流配送车辆调度问 题研究ｌＪ１＿数学的实践与认识，２００４，３４（６）：９３—９７． （上接１２０页） ｍｏｔｏｒ ｓｔｅｐ） ｍｏｔｏｒ ｓｔｅｐ） 图６图像自相关算子的图像清晰度评价曲线 图５灰度方差和灰度梯度算子的图像清晰度评价曲线 满足了普通生物医学研究的需要，具有一定的实际应用价值。 设计时，采用了图像自相关算子Ｈ】来进行图像清晰度评价， 图像自相关算子表示为： Ｍ—Ｉ Ｎ Ｍ （收稿１３期：２００７年２月） Ｃｏｒ＝∑∑【厂（ √） １， ）卜∑∑【厂（ √） ＋ √）】 ｉ＝１ ｊ＝ｌ ｉ＝１ ｊ＝ｌ 参考文献： ［１］孙明磊，宗光华，余志伟，等．基于图像分析的显微视觉自动聚焦系 统ｌ Ｊｌ—Ｅ京航空航天大学学报，２００５，３１（２）：１９２—１９６． 其中， 、Ⅳ表示图像大小 为整数 ， ）表示（ｉ， ）处的图像 灰度值，ｋ为一个描述自相关程度的系数。ｋ值越大，图像自相 ［２］郑春阳，李永新，李胜利．用于ＣＣＤ图像采集的自动聚焦控制系统 设计ｌ Ｊ１．钡０控技术，２００４，２３（５）：５１—５３． 关的程度越小，Ｃｏｒ的最大值表示最佳的清晰度。 在相同实验条件下，用图像自相关算子对细胞图像做清晰 度评价，得出如图６所示的分析曲线。可以看出，当自相关常数 ｋ取５时，曲线从峰值到最小值有较快的衰减，随着ｋ值的增 大，曲线的衰减变慢，但单峰性变好。当ｋ取不同值的时候，曲 线簇出现一个共同的峰值点，该点即对应着最佳清晰度（即最 ［３］姜志国，韩冬兵，袁天云，等．基于全自动控制显微镜的自动聚焦算 法研究ｌＪ］．中国图象图形学报，２００４，９（４）：３９６—４０１． ［４］Ｓａｎｔｏｓ Ａ，Ｏｒｔｉｚ ｄｅ Ｓｏｌｏｒｚａｎｏ Ｃ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｆｏｃｕｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｙｔｏｇｅｎｅｔｉｅ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，１９９７，１８８ （３）：２６４—２７２． 佳聚焦）位置。使用时，ｋ取—个适当的值即可，如ｋ＝１０。 ［５］宗光华，孙明磊，毕树生，等．显微视觉自动聚焦研究ｌＪ１．光学学报， ２００５，２５（９）：１２２５—１２３１． ５结束语 本文提出了一套性价比较高的光学显微自动聚焦系统的 设计方案。实验结果表明，针对黑白ＣＣＤ相机拍摄的低对比度 生物样品图像，显微镜的物镜扫描整个行程时，运动控制时间 在３ ｓ以内，完成整个图像清晰度自动评价分析和自动聚焦控 ［６］李毅，问新民，苟大举．显微镜载物台自动控制及自动聚焦系统设 计ｌ Ｊ１．计算机应用研究，２００２（１１）：９２—９３． ［７］黄桂灶，徐向东，陆祖康，等．单片机处理信号的自动聚焦系统ｌＪ１．光 电工程，２００２，２９（１）：４２—４４． ［８］方以，郑崇勋，闰相国．显微镜自动聚焦算法的研究［Ｊ１．仪器仪表学 报，２００５，２６（１２）：１２７５—１２７７． 制的时间在７ ｓ以内，显微自动聚焦的准确度与实时性较好地