庆大霉素诱导大鼠肾小管间质纤维化模型的建立

２００８年９月　中国比较医学杂志　ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００８　Ｖ０１．１８　Ｎｏ．９　、　第１８卷第９期　￥　）　研究报告５５　蝗　；　；　；　、　庆大霉素诱导大鼠肾小管间质纤维化模型的建立　王　飞　，陆海英　，张　悦　，郝艳鹏　，周　娟　，刘煜敏　，陆　敏　（１．上海中医药大学科技实验中心；２．上海中医药大学护理学院，上海２０１２０３）　【摘要】　目的探讨庆大霉素肾毒性损伤能否诱导一种新的肾间质纤维化模型。方法３１只健康雄性Ｗｉｓｔｅｒ　大鼠随机分为４组：正常组Ｉ、模型组Ｉ（造模后５　ｄ取材）组；正常组Ⅱ、模型组Ⅱ（造模后３０　ｄ取材）组。给予庆大　霉素造成肾毒性损伤，分别于造模后５　ｄ和造模后３０　ｄ处死，光镜和电镜下动态观察肾组织形态学改变，计算肾系　数、检测血肌酐、血尿素氮、２４小时尿蛋白总量，氧化应激相关指标ＳＯＤ、ＭＤＡ、ＮＯＳ的变化，检测ＮＦ－ｔｃＢ蛋白表达水　平。结果　（１）模型组Ｉ大鼠：光镜下可见肾小管上皮细胞以变性为主，部分坏死；有较多的蛋白管型和少量的细胞　管型、颗粒管型。电镜下可见肾小管上皮细胞胞浆中有大量脂滴存在，细胞的线粒体肿胀、内质网明显扩张。肾系　数常、血肌酐、血尿素氮、２４　ｈ尿蛋白总量，以及ＭＤＡ、ＮＯＳ明显高于正常组Ｉ（Ｐ＜０．０１），模型组Ｉ　ＮＦ－ｔｃＢ蛋白表达水　平明显高于正常组Ｉ（Ｐ＜０．Ｏ１）；ＳＯＤ明显低于正常组Ｉ（Ｐ＜０．Ｏ１）。（２）模型组Ⅱ大鼠：肾小管上皮细胞以坏死为　主，部分上皮细胞变性，可见肾小管萎缩和扩张，有较多的细胞管型和颗粒管型，间质中有成纤维细胞增生和炎症　细胞浸润，间质明显增宽。电镜下可见模型组Ⅱ大鼠肾小管上皮细胞核固缩、碎裂现象；间质中有较多的胶原纤　维，成纤维细胞增多。模型组Ⅱ大鼠血肌酐、血尿素氮、２４　ｈ尿蛋白总量明显高于正常组Ⅱ（Ｐ＜０．Ｏ１）。结论　氧　化应激引起的脂质过氧化损伤参与了庆大霉素所致的肾小管上皮细胞变性坏死，后者导致了慢性炎症和修复的反　复进行，最终导致肾间质纤维化。　【关键词】　急性肾损伤；间质纤维化；氧化应激　【中图分类号】Ｒ６９２．１　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７１—７８５６（２００８）０９．００６０—０５　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　Ｒａｔ　Ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　Ｒｅｎａｌ　Ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ　Ｆｉｂｒｏｓｉｓ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ　ＷＡＮＧ　Ｆｅｉ’ＬＵ　Ｈａｉ—ｙｉｎ　，ＺＨＡＮＧ　Ｙｕｅ　，ＨＡＯ　Ｙａｎ—ｐｅｎｇ’，ＺＨＯＵ　Ｊｕａｎ’，ＬＩＵ　Ｙｕ—ｍｉｎｇ‘，ＬＵ　Ｍｉｎｇ　，（１．Ｅｘｐｅｆｉｍｅｎｅｅ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０１２０３，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　ｎｕｒｓｉｎｇ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０１２０３，Ｃｈｉｎａ）　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｒｅｎａｌ　ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｒｅｎａｌ　ｔｏｘｉｃ　ｉｎｊｕｒｙ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ｇｅｎｔａｍｉｅｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　３１　ｈｅａｌｔｈｙ　ｆｅｍａｌｅ　Ｗｉｓｔｅｒ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ　ｉｎｔｏ　４　ｇｒｏｕｐｓ：ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ　Ｉ，ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｌ　ｇｒｏｕｐ（ｅｘｅｃｕｔｅｄ　５　ｄａｙｓ　ａｆｔｅｒ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ）；ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐⅡ，ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐⅡ（ｅｘｅｃｕｔｅｄ　３０　ｄａｙｓ　ａｆｔｅｒ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ）．Ｔｈｅ　ｒｅｎａｌ　ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ．Ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｅｃｕｔｅｄ　５　ｏｒ　３０　ｄａｙｓ　ａｆｔｅｒ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｌｉｇｈｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ａｎｄ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｒｅｎａｌ　ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｗｅｒｅ　ｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｎａｌ　ｉｎｄｅｘｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ，ｂｌｏｏｄ　ｕｒｅａ　ｎｉｔｏｇｅｎ，ｔｒｏｔａｌ　ｕｆｉｎａ￣ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　２４　ｈ，ａｎｄ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ．ｒｅｌａｔｅｄ　ｉｎｄｅｘｅｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ＳＯＤ，ＭＤＡ　ａｎｄ　ＮＯＳ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＮＦ—ｘＢ　Ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　（１）Ｒａｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　Ｉ　ｇｒｏｕｐ：ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｌｉｇｈｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｉｔ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｍａｉｎｌｙ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐａｒｔｌｙ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｎａｌ　ｔｕｂｕｌａｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｎｓ；ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｍａｎｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃａｓｔｓ　ａｎｄ　ａ　ｆｅｗ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｓｔｓ　ａｎｄ　ｇｒａｎｕｌａｒ　ｃａｓｔｓ．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｅｌｅｃｔｏｎ　ｒ［基金项目］国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０５００６８７）；上海市高等学校科学技术发展基金项目（Ｎｏ．０５ＣＺ２３）；上海市教育委员会重点学科　（第五期）Ｊ５０３０１。　【通讯作者】张悦。Ｅｍａｉｌ：ｙｕｅｚｈａｎｇ—ｓｈａｎｇｈａｉ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ　中国比较医学杂志２００８年９月第ｌ８卷第９期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｏｍｐ　Ｍｅｄ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２００８，Ｖｏ１．１８．Ｎｏ．９　６ｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ａ　ｌａｒｇｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｌｉｐｉｄ　ｄｒｏｐｌｅｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｋｙｔｏｐｌａｓｍ　ｏｆ　ｒｅｎａｌ　ｔｕｂｕｌａｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ，ｓｗｏｌｌｅｎ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｂｉｏｂｌａｓｔｓ，　ａｎｄ　ａｐｐａｒｅｎｔ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｔｈｅ　ｒｅｎａｌ　ｉｎｄｅｘｅｓ，ｓｅｌｘｌｍ　ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ，ｂｌｏｏｄ　ｕｒｅａ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ，ｔｏｔａｌ　ｕｒｉｎａｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　２４　ｈ．ＭＤＡ　ａｎｄ　ＮＯＳ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ　Ｉ（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１）；Ｗｈｉｌｅ　ＳＯＤ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ　Ｉ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＮＦ—ｓ：Ｂ　ｉｎ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍｏｌ　ｇｒｏｕｐ　Ｉ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ（Ｐ　＜Ｏ．Ｏ１）．（２）Ｒａｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌⅡｇｒｏｕｐ：Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｌｉｇｈｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｉｔ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｍａｉｎｌｙ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｐａｒｔｌｙ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｎａｌ　ｔｕｂｕｌａｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ，ａｔｒｏｐｈｙ　ａｎｄ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｎａｌ　ｔｕｂｕｌｅ，ｍａｎｙ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｓｔｓ　ａｎｄ　ｇｒａｎｕｌａｒ　ｃａｓｔｓ．ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ａｎｄ　ｉｎｆｉｈｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅ．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｉｔ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｋａｒｙｏｐｙｋｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｎａｌ　ｔｕｂｕｌａｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ，ａ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｌａｒｇｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｆｉｂｅｒｓ　ａｎｄ　ａｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅ．Ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌⅡｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｓｅｒｕｍ　ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ，ｂｌｏｏｄ　ｕｒｅａ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ，ａｎｄ　ｔｏｔａｌ　ｕｒｉｎａｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　２４　ｈ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ　１１（Ｐ＜０．０　１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｔｈｅ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｎａｌ　ｔｕｂｕｌａｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌａｔｔｅｒ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ　ｒｅｐａｉｒ，ｅｖｅｎｔｕａｌｌｙ　ｌｅａｄｉｎｇ　ｔｏ　ｒｅｎａｌ　ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ａｃｕｔｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｉｎｊｕｒｙ；Ｉｎｔｅｓｒｔｉｔｉａｌ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ；Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　庆大霉素是治疗革兰氏阴性菌感染的一种很有　性、丙二醛（ｍａｌｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）含量、一氧化氮合酶　效的抗生素。不过，在治疗的病例中，它引起了　（ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＮＯＳ）活性、尿蛋白含量测定试　１０％～２Ｏ％的肾衰。有研究已经表明庆大霉素诱导　剂盒购自南京建成生物有限公司。其他试剂均为国　的肾毒性以肾小管坏死为特征，而且主要发生在近　产分析纯。兔抗大鼠ＮＦ—ＫＢ　ｐ６５抗体购自Ｃｅｌｌ　端小管　。　。庆大霉素所诱导肾炎的确切机制仍然　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ公司，小鼠抗大鼠ａ．ＳＭＡ抗体购自Ｓｉｇｍａ公　不清楚，然有研究表明庆大霉素增强了反应性氧簇　司，小鼠来源ＧＡＰＤＨ（甘油醛一３一磷酸脱氢酶）多抗购　（ＲＯＳ）的产生　’　。在不同的病理状态下，包括不同　于上海康成公司，辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的山　的肾病模型，ＲＯＳ已经被认为是细胞死亡的一个引　羊抗兔及山羊抗小鼠Ⅱ抗购于晶美生物工程有限公　起因素　。本研究应用庆大霉素所致大鼠肾毒性损　司，ＰＶＤＦ膜购于Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司。酶标仪、电泳装置　伤模型，观察氧化应激过程中，正常组和模型组ＳＯＤ　为美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司产品，光学显微镜由日本　的活性变化情况，并观察造模后５　ｄ、３０　ｄ，肾功能和　Ｏｌｙｍｐｕｓ公司生产。紫外分光光度计为上海精密科　肾小管间质的变化情况，以探讨从急性肾小管损伤　学仪器有限公司生产。　到间质纤维化的演变机制。　１．４肾系数的测定　１材料和方法　将大鼠处死后，迅速开腹取两侧全肾，用滤纸吸　干肾表面血液后称重。肾系数＝两侧肾质重和（ｇ）／　１．１动物分组　体质重（Ｋｇ）Ｘ　１００％。　健康雄性Ｗｉｓｔｅｒ大鼠３１只，（购自上海斯莱克　１．５血肌酐（ＳＣｒ）、血清尿素氮（ＢＵＮ）的测定　实验动物有限责任公司，合格证号：ｓｃｘｋ（沪）２００７．　血清肌酐、血清尿素氮、尿肌酐由日立７０８０全　０００５），体重１６０　４－２０　ｇ。随机分为正常组Ｉ（造模后５　自动生化分析仪（ＨＩＴＡＣＨＩ７０８０　Ａｕｔｏｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ）　天取材）６只，模型组Ｉ（造模后５　ｄ取材）６只；正常　检测。　组Ⅱ（造模后３０　ｄ取材）６只；模型组Ⅱ（造模后３０　１．６　各组大鼠肾组织匀浆ＳｏＤ和ＮＯＳ活性和　ｄ取材）１３只。　ＭＤＡ含量。２４　ｈ尿蛋白总量的测定　１．２大鼠急慢性肾损伤模型的制备　取材前一天用代谢笼收集大鼠２４　ｈ尿液，用于　以８Ｏ　ｍｇ・ｋｇ。。・ｄ　腹腔注射硫酸庆大霉素注射　测定尿蛋白含量。肾组织置一７０℃冰箱保存，分别　液，２次／ｄ，持续９　ｄ，分别在造模后５　ｄ和３０　ｄ经腹　取处死时冻存的双侧部分肾皮质称重，每样本加１　主动脉取血后处死大鼠；对照组腹腔注射等容量的　ｍＬ预冷的生理盐水，冰水浴中匀浆，于４ｃＩ＝，１　０００　ｒ／　生理盐水于上述两个时问点处死。　ｍｉｎ离心１５　ｍｉｎ，取上清液检测。按照南京建成生物　１．３主要试剂和仪器　公司试剂盒提供的方法测定２４　ｈ尿蛋白含量、ＭＤＡ　硫酸庆大霉素购自上海第一生化药业有限公　含量、ＮＯＳ和ＳＯＤ活性，同时按ＢＣＡ法测定匀浆液　司，超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）活　蛋白质浓度。　６２　中国比较医学杂志２００８年９月第ｌ８卷第９期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｏｍｐ　Ｍｅｄ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２００８，Ｖｏ１１８．Ｎｏ．９　．１．７肾组织形态学观察　处死时，３％戊巴比妥钠麻醉大鼠后打开腹腔取　两侧肾脏，取双肾部分组织，１０％多聚甲醛固定，常　规石蜡包埋，切片（３　ｔｔｍ），做苏木精．伊红（ＨＥ）染　荡过夜，１×ＴＢＳ洗３次，每次１０　ｍｉｎ。置ＨＲＰ标记　的Ⅱ抗（用封闭液１：５　０００稀释）中孵育２　ｈ，１×ＴＢＳ　洗３次，每次１０　ｍｉｎ，在暗室，取ＥＣＬ试剂Ａ和Ｂ各　１　ｍＬ，混合后覆盖膜上，１．５　ｍｉｎ后弃去化学发光试　色，光镜下观察肾组织形态学变化；４％戊二醛固定　部分肾组织后于Ｐｈｉｌｉｐｓ　Ｔ型透射电镜下观察肾小管　上皮及肾间质超微结构的变化。　１．８　ＮＦ．ＫＢ的检测　利用Ｗｅｓｔｅｒｎ．ｂｌｏｔ法分别检测模型组Ｉ的ＮＦ．ｘＢ　剂，将膜放人暗盒内，用ｘ光胶片进行曝光、显影及　定影。条带相对灰度值＝目的条带灰度值／同个样　品ＧＡＰＤＨ灰度值。　１．９统计学处理　实验数据以均数４－标准差（贾±ｓ）表示，运用　ＳＰＳＳ１２．０进行Ｏｎｅ．ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ检验或ｔ检验，比较　各组变量间的差异。　２结果　的表达情况，以正常组作对照。将定量好的组织蛋　白按比例加入５×ＬＢ上样缓冲液，混匀后置入沸水　中加热１０　ｍｉｎ，以使蛋白变性，即为可电泳的样品。　每孔加５０　ｎｇ的蛋白样品电泳，积层胶电压８０　Ｖ，分　离胶电压１５０　Ｖ。电泳结束后转膜１～２　ｈ（经甲醇处　理的ＰＶＤＦ膜），将转有蛋白的膜置于５％ＢＳＡ封闭　１　ｈ后，置于Ｉ抗（ＮＦ．ＫＢ用封闭液１：１　０００稀释，　２．１大鼠肾系数的变化　造模后５　ｄ、３０　ｄ取材时，肾系数均显著高于正　常组（Ｐ＜０．０１）（表１，表２）。　ＧＡＰＤＨ作内参按１：５　０００稀释）中，置４￣Ｃ冰箱中振　表１正常组和模型组Ｉ大鼠肾功能的比较　Ｔａｂ．１　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｆｏｒ　ｒｅｎａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｄｅｘ　ｏｆ　ｌｉｐｉｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｄｅｌ　Ｉ　ｇｒｏｕｐ　ｉｎ　ｒａｔｓ　注：与正常组比较，”Ｐ＜０．Ｏｌ。　Ｎｏｔｅ：ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ．“Ｐ＜０．Ｏｌ　表２正常组和模型Ⅱ组大鼠肾功能的比较　Ｔａｂ．２　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｆｏｒ　ｒｅｎａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｄｅｌ　ＩＩ　ｇｒｏｕｐ　ｉｎ　ｒａｔｓ　注：与正常组比较。　Ｐ＜０．Ｏｌ。　Ｎｏｔｅ：ｃｏ￣ｆｌｌ＇ｅｄｗｉｔｈ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ．“Ｐ（Ｏ．Ｏ１　２．２血肌酐（ＳＣｒ）、血清尿素氮（ＢＵＮ）、的测定　０．Ｏ１），见表１。模型组Ⅱ（造模后３０　ｄ取材）血肌酐　（ＳＣｒ）、血清尿素氮（ＢＵＮ）明显高于正常组Ⅱ（Ｐ＜　０．０１）（表３）。　、　模型组Ｉ（造模后５天取材）大鼠的血肌酐　（ＳＣｒ）、血清尿素氮（ＢＵＮ）均明显高于正常组Ｉ（Ｐ＜　表３正常组和模型组Ｉ大鼠脂质过氧化指标的比较　Ｔａｂ．３　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｆｏｒ　ｉｎｄｅｘ　ｏｆ　ｌｉｐｉｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｄｅｌ　Ｉ　ｇｒｏｕｐ　ｉｎ　ｒａｔｓ　、　注：与正常组比较，“Ｐ（０．Ｏｌ。　Ｎｏｔｅ：ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｈ　ｎｏｒｔｍａｌ　ｇｒｏｕｐ．”　尸＜０．Ｏ１　中国比较医学杂志２００８年９月第１８卷第９期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｏｍｐ　Ｍｅｄ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２００８，Ｖｏ１．１８．Ｎｏ．９　６３　２．３肾组织中ＳＯＤ、ＮＯＳ活性和ＭＤＡ含量的变　化。大鼠２４　ｈ尿蛋白总量的变化　模型组Ｉ肾组织中ＳＯＤ活性明显低于正常组，　同时ＭＤＡ含量和ＮＯＳ活性明显高于正常组Ｉ（Ｐ＜　０．０１），模型组Ｉ和模型组Ⅱ大鼠２４　ｈ时尿蛋白总　量明显高于相应正常组（Ｐ＜０．０１）（表３）。　２．４肾组织形态学变化　光镜下可见正常组大鼠肾小管结构完整，小管　间排列紧密（图１）。模型组Ｉ大鼠肾小管上皮细胞　以变性为主，包括细胞肿胀和脂肪变性；有较多的蛋　白管型和少量的细胞管型、颗粒管型，间质中有少量　的炎症细胞浸润，但问质结构清楚、间质纤维组织增　生不明显（图２）。模型组Ⅱ大鼠肾小管上皮细胞以　坏死为主，部分上皮细胞变性，可见肾小管萎缩和扩　张，有较多的细胞管型和颗粒管型，问质中有较多的　炎症细胞浸润，间质纤维组织增生明显，可见较多的　成纤维细胞，细胞外基质增多，间质明显增宽（图　３）。电镜下可见模型组Ｉ肾小管上皮细胞胞浆中有　大量脂滴存在，粗面内质网脱颗粒，线粒体水肿，嵴　被破坏减少，胞质内可见溶酶体吞噬坏死细胞碎片　所形成的吞噬一溶酶体复合体。模型组Ⅱ大鼠肾小　管上皮细胞核固缩、碎裂现象；间质中有较多的胶原　纤维，成纤维细胞增多（图４～７）。　２．５　ＮＦ．ＫＢ的检测　模型组Ｉ大鼠肾组织ＮＦ—ｘＢ水平明显高于正常　组Ｉ（Ｐ＜０．０１）（表４，图８）。　表４正常组和模型Ｉ组大鼠。肾组织　ＮＦ—ｔｃＢ蛋白表达水平的比较　Ｔａｂ．４　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＮＦ—ｔｃＢ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｄｅｌ　１　ｇｒｏｕｐ　注：与正常组比较，“Ｐ（０．０１。　Ｎｏｔｅ：ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ．“Ｐ（０叫　３讨论　庆大霉素是一种应用广泛的氨基糖苷类抗生　素，它可以导致肾小管坏死　。一些报道已经阐述　了氨基糖苷类抗生素引起的肾损害的病理过程，如　溶酶体，线粒体及细胞膜结构的紊乱　。本研究结　果显示，在给予庆大霉素造模９　ｄ后的第５天，大鼠　的肾系数（ｒｅｎａｌ　ｉｎｄｅｘ），血肌酐（ＳＣｒ）、血清尿素氮　（ＢＵＮ）、尿肌酐（ＵＣｒ）均明显高于对照组（Ｐ＜０．０１），　光镜及电镜下可见肾小管上皮细胞以变性为主，包　括细胞肿胀和脂肪变性；部分小管上皮细胞坏死；有　较多的蛋白管型和少量的细胞管型、颗粒管型。表　明早期急性。肾损伤模型复制成功。到造模后第３０　天，可见肾小管萎缩和扩张，小管上皮细胞坏死多　见；有较多的细胞管型和颗粒管型，间质中有较多的　炎症细胞浸润，间质纤维组织增生明显，可见较多的　成纤维细胞，细胞外基质增多，问质明显增宽。是否　可将此作为研究肾间质纤维化的一个模型，国内外　尚未报道，还有待于进一步研究。许多研究结果表　明，在肾组织，不同氧化应激生化指标浓度的变化与　庆大霉素有关　。庆大霉素引起细胞膜脂质构成的　快速改变，此膜质构成的变化可能被自由基引起的　脂质过氧化所诱导　’　自由基引起膜质结构的破坏　和脂质过氧化产物自身催化反应，细胞膜破坏导致　渗透平衡的丧失和细胞内高钙，在光镜下观察到的　细胞浊肿是这一系列可逆性反应的第一个表象。本　研究表明，在给予庆大霉素造模９　ｄ后的第５天，与　对照组比较，ＳＯＤ的活性明显降低，ＮＯＳ活性明显增　加，ＭＤＡ生成明显增加。　慢性肾病的组织学特点，诸如：间质纤维化、小　管萎缩或扩张，都可以在本实验中观察到，而小球结　构基本完整。以前有报道称，在造模后３０　ｄ，肾皮质　小管间质的破坏区域是２３．２％，并且，发生硬化的　。肾小球的比率为６．４％，而肾功能是部分恢复的。　在本实验中，模型组Ⅱ大鼠的Ｓｃｒ、ＢＵＮ、２４　ｈ尿蛋白　较正常组仍有显著性升高，但升高幅度小于造模组　Ｉ，由此推断，部分变性的肾小管结构恢复正常，肾功　能被部分代偿，而发生永久性损伤的区域，以及小管　萎缩所空出的空间，被纤维组织占据了，如本实验中　所观察到的，小管间质发生了纤维化　。在对ＵＵＯ　模型的研究中发现小管间质纤维化的发生与ＴＧＦ．　８ｌ所激活的Ｓｍａｄ通路有关　，是否本实验中发生　的纤维化也与ＴＧＦ．Ｊ３所激活的Ｓｍａｄ通路有关，还有　待于进一步研究。（图１～８见插Ⅻ）　参考文献：　［１］Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ　Ｓ，Ｍａｚｚｏｎ　Ｅ，Ｄｕｇｏ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｒｏｌｅ　ｆｏｒ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｉｎｇｅｎｔａｍｉｃ　ｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｅｏｌ，２００２，　４５０（１）：６７—７６．　［２）Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ　ＪＭ，Ｋｏｆｆｅｒ　Ｈ，Ｇｌｉｃｋ　ＨＡ，ｅｔ　ａ１．Ｗｈａｔ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｃｏｓｔ　ｏｆ　ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｅｉｔｙ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｍｉｎｏｇｌｙｅｏｓｉｄｅｓ［Ｊ］？Ａｎｎ　Ｉｎｔｅｒｎ　Ｍｅｄ，　中国比较医学杂志２００８年９月第ｌ８卷第９期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｏｍｐ　Ｍｅｄ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２００８，Ｖｏ１．１８．Ｎｏ．９　１９８７，１０７（６）：９００—９Ｏ９．　Ｐｈａｒｎｌａｃｏｌ，１９８３，３２（２１）：３２１３—３２２０．　［３］　Ｐｅｄｒａｍ－Ｃｂｅｖｅｒｒｉ　Ｊ，Ｇｏｎｚｌｅｚ—Ｏｒｏｚｃｏ　ＡＥ，Ｍａｌａｄｏｎａｄｏ　ＰＤ，ｅｔ　ａ１．　Ｄｉｌｌａｙｌ　ｄｉｓｕｌｉｆｄｅ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ　ｇｅｎｔａｍｉｅｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　［９］　Ｄｕ　ＸＨ，Ｙａｎｇ　ＣＬ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｇｅｎｔａｍｉｅｉｎ　ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｚｉｎｃ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｅｔｌｌａｏｔｈｉｏｎｅｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｅｏｌ，２００３，４７３（１）：７１—７８．　ｄａ　Ｃ，Ｉｔｏ　Ｋ，Ｋｏｍｉｙａ　Ｉ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｆｏｓｆｏｍｙｃｉｎ　［４］　Ｙａｎａｇｉ［Ｊ］．Ｎｅｐｈｒｏｌ　Ｄｉａｌ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１９９４，９（１４）：１３５—１４０．　［１０］　Ｓａｎｄｈｙａ　Ｐ，Ｖａｒａｌａｋｓｈｍｉ　Ｐ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｌｉｏｉｅｐ　ａｃｉｄ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｏｎ　ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ・ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｔ　ｒｅｎａｌ　ｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ　Ｂｉ０ｌ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ，２００４，１４８（３）：１３９—１４７．　ａｌｅｓ　ＡＩ，Ｂｕｉｔｒａｇｏ　ＪＭ，Ｓａｎｔｉａｇｏ　ＪＭ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　［５］　Ｍｏｒｇｅｎｔａｍｉｅｉｎ．ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｊ　Ａｐｐｌ　Ｔｏｘｉｅｏｌ，　１９９７。１７（６）：４０５—４０８．　Ｇｅｌｅｉｌｅｔｅ　ＴＪ，Ｍｅｌｏ　ＧＣ，Ｃｏｓｔａ　ＲＳ，ｅｔ　ａ１．Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－　ｂｅｔａ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ，　ｔｒａｎ￣ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　ｏｎ　ｇｅｎｔａｍｌｅｉｎ－ｉｎｄｕｅｅｄ　ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｌ　Ｊ　ｊ．Ａｎｔｉｏｘｉｄ　Ｒｅｄｏｘ　ｓｉｓ￣ａｌ，２００２，４（６）：８９３—８９８．　Ｂａｌｉｇａ　Ｒ，Ｕｅｄａ　Ｎ，Ｗａｌｋｅｒ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｏｘｉｄａｎｔ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　ｔｏｘｉｃ　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ一１Ｉ，ａｎｄ　ｉｆｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｌ　ａｎｅｐｈｒｉｔｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｎｅｐｈｍｌ，２００２，１５（６）：６３３—　ａｃｕｔｅ　ｒｅｎａｌ　ｆａｉｌｕｒｅ　ｄｒｕｇ［Ｊ］．Ｍｅｔａｂ　Ｒｅｖ，１９９９，３１（４）：９７１—９９７．　［７］　Ｌａｕｒｅｎｔ　Ｇ，Ｋｉｓｈｏｒｅ　ＢＫ，Ｔｕｌｋｅｎｓ　ＰＭ，ｅｔ　ａ１．Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ—　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｎａｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ［Ｊ］．Ｂｉｃｅｈｅｍ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９０，４０（１１）：２３８３—２３９２．　［８］　Ｐｏｗｅｌｌ　ＪＨ，Ｒｅｉｄｅｎｂｅｒｇ　ＭＭ．Ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｋｉｄｎｅｙ　ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ　ｔｏ　ａｍｉｎｏｇｌｙｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｃｅｈｅｍ　６４２．　［１２］　Ｈａｙａｓｈｉｄａ　Ｔ，Ｈｕｂｃｈａｋ　ＳＣ．ＴＧＦ－－ｂｅｔａ　ｓｉ　ｔｒｎａｓｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｅｓａｎｇｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｒｅｎａｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００３，　２８４（２）：Ｆ２４３—２５２．　［修回日期）２００８．０８．０８