蛋白纯化方法(从Cell文章中学到的高效蛋白纯化方法)

一、 简介 ....................................................................................... 2 二、 pSSB载体 ............................................................................... 2 三、 插入基因片段 ........................................................................ 3 四、 优化表达 ................................................................................ 3 五、 ssDNA-cellulose ...................................................................... 4 六、 纯化 ....................................................................................... 4 七、 操作说明 ................................................................................ 5 八、 应用举例 ................................................................................ 6 九、 纯化方法的问题解决 .......................................................... 10

说明书中的应用实例都发表在国际学术权威期刊上，如Cell等，望大家学习！如需这些高水平文章原文，请发邮件至service1@cellgenbiolabs.com，我将为您提供原文。

Beijing Cellgen Biolabs Co.,Ltd. www.cellgenbiolabs.com SSB亲和层析使用说明书

一、 简介

噬菌体T7 单链DNA结合蛋白（SSB, single-stranded DNA binding protein）由696bp核苷酸编码，计算分子量为 25.6kDa（SDS-PAGE凝胶电泳，该蛋白条带约在27 kDa位置）。它与单链DNA有很强的亲和性，且无序列特异性。利用这一特性，将SSB构建到不同宿主的表达载体中，可以实现在不同宿主中表达带有SSB标签的融合蛋白，从而与偶联在介质中的单链DNA高效、特异性结合，这种结合是可逆的，能够在温和、非变性的条件下通过改变洗脱液的pH值或盐浓度对融合蛋白进行洗脱，达到纯化某一目标蛋白的目的。

pSSB系列载体用于构建可诱导、高水平表达的基因或基因片段，表达的融合蛋白的N端或C端带有SSB标签。SSB标签可根据需要由位点特异的蛋白酶切除，pSSB系列质粒上多克隆位点上游包含有肠激酶（enterokinase）、凝血酶、TEV等识别序列。带有标签的蛋白可以通过免疫学方法进行检测，同时根据实验需要决定是否切除标签。

SSB亲和层析介质（经过特殊处理的ssDNA-cellulose）是专门设计用于纯化SSB融合蛋白及与目的蛋白有亲和作用的蛋白复合体的分离介质，通过盐离子梯度洗脱可得到高纯度的SSB融合蛋白。纯化条件温和，不引入其他物质，能够保证蛋白的活性。

二、 pSSB载体

现有的pSSB载体系列按宿主不同可以分为以下四类：1）大肠杆菌类; 2）酵母类; 3）人细胞类；4）昆虫细胞类。每一个类别中均含有带有N端和C端的SSB标签质粒，每个质粒都含有相应的蛋白酶切位点，可以根据实验需要，将SSB标签从融合蛋白中切去。在不同的宿主载体中，它们的启动子也各不相同，通过各自的启动子实现严格插入片段的表达。相关参数如下页表一所示：

Beijing Cellgen Biolabs Co.,Ltd. www.cellgenbiolabs.com 表一：pSSB系列载体

SSB位于目的蛋白的N端或C端 N端 N端 N端（SSB(△26C)标签） N端 N端 C端 N端 N端 C端 N端 C端 N端 C端 蛋白酶切位点 肠激酶 肠激酶 肠激酶 凝血酶 凝血酶 肠激酶 肠激酶 肠激酶 肠激酶 TEV 肠激酶 肠激酶 肠激酶 是否带His标签 否 是 是 是 否 是 是 是 是 是 是 是 是 宿主 载体 抗性 启动子 pSSB-E1 pSSB-E2 大肠杆菌E.coli pSSB-E3 pSSB-E4 pSSB-E5 pSSB-E6 pSSB-Y1 酵母Yeast 人细胞Human 昆虫细胞 Insect pSSB-Y2 pSSB-Y3 pSSB-H1 pSSB-H2 pSSB-I1 pSSB-I2 卡纳抗性 卡纳抗性 卡纳抗性 卡纳抗性 卡纳抗性 卡纳抗性 卡纳抗性 氨苄抗性 氨苄抗性 氨苄抗性 氨苄抗性 氨苄抗性 氨苄抗性 T7 T7 T7 T7 T7 T7 nmt1 nmt1 nmt1 CMV CMV PH PH 具体信息详见网站：www.cellgenbiolabs.com。

三、 插入基因片段

每一个pSSB表达载体设计有多个克隆位点。 根据需要，DNA片段可被插入到某一特定的位点。

四、 优化表达

插入DNA片段的方向和载体的连接确定无误后，下一步将要优化带SSB标签融合蛋白的表达，确定了最佳的蛋白表达水平及相应的生长条件后就可以进行大规模的培养。

生长条件应考虑最佳的蛋白表达水平，确定一系列诸如培养基、生长温度、密度、诱导条件等参数。保证足够的通气条件、缩短各个生长时期的时间以及使用正确的抗生素进行筛选都是非常重要的。同时应当确定表达的融合蛋白是在包涵体状态或可溶状态。SSB在一定程度上可以促进目的蛋白的溶解，但有时候会

Beijing Cellgen Biolabs Co.,Ltd. www.cellgenbiolabs.com 因为过度表达而导致蛋白不能以正确的方式折叠，从而形成包涵体。为降低包涵体的形成，可以适当调整培养基条件来提高重组蛋白的溶解能力，如：生长温度降低至15-30℃，增加通气，改变诱导条件如降低蛋白表达的速率等。

五、 ssDNA-cellulose

ssDNA-cellulose由单链DNA（ssDNA）与处理过的cellulose进行偶联所得，大约1g cellulose可以偶联2-3mg 的ssDNA。ssDNA可以与SSB特异性结合，且1ml 溶胀好的ssDNA-cellulose柱料可以结合1-2mg 的带有SSB 标签的融合蛋白。此介质是自主设计合成的，具有优良的物理和化学稳定性，操作方便，批次重复性好，是研发的理想选择，具体性能参数如表二所示：

表二：ssDNA-cellulose的性能参数

特点 基质 吸附载量 介质平均直径 pH范围 保存温度 保存条件 成本低，操作方便 纤维素 1ml吸附1-2mg的SSB融合蛋白 100μm 3-10 4-8℃ 干燥保存

六、 纯化

SSB标签蛋白可以通过亲和层析柱（ssDNA-cellulose）比较方便的从细胞裂解物中纯化。纯化时，标签蛋白与配体结合，杂质通过结合缓冲液被洗脱去除，之后标签蛋白在温和、非变性的条件下被洗脱下来，可以使蛋白的抗原性能和功能得以保护。

如果需要将SSB标签从目的蛋白上切除，标签蛋白可以在与ssDNA-cellulose结合时使用合适的位点特异性蛋白酶酶切，也可在洗脱之后再酶切，在标签蛋白与介质结合时酶切可以节省分离SSB标签与目的蛋白的步骤，因为这样在洗脱目

Beijing Cellgen Biolabs Co.,Ltd. www.cellgenbiolabs.com 的蛋白时SSB标签仍旧结合在介质上。

七、 操作说明

1) 缓冲液配制：

TE：10mM Tris-HCl （pH=8.0），1mM EDTA;

结合缓冲液：50 mM Tris-HCl (pH=8.0), 100 mM NaCl 或 100 mM KCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol。（结合缓冲液的盐浓度可以根据要纯化的蛋白性质来调节）

2) 操作步骤：

1、 取适量ssDNA-cellulose干料，用TE缓冲液溶胀约2-4个小时。0.2g干料可溶胀为1ml 柱材料。装入层析柱后，用5-10倍的柱体积的TE（pH=8.0）洗涤柱子，将未偶联的多余DNA去除。

2、用结合缓冲液平衡柱子5-10个床体积。

3、用上述结合缓冲液溶解表达的带有SSB标签融合蛋白的细胞，然后将其超声破碎或者裂解破碎，细胞裂解液高速离心后取其上清，缓慢注入层析柱，如果样品挂柱效率低，可降低流速及重复上样。上样完毕后用平衡缓冲液再洗至基线。 4、用5-10个柱床体积的低盐（~0.1 M NaCl 或 KCl）缓冲液洗脱杂蛋白。 5、然后，梯度性地提高盐浓度，洗脱目的蛋白。

3) 柱子再生：

如果连续重复纯化同一个蛋白，柱子可以再生：首先用含有1.5M或2M的高盐缓冲液清洗柱子5-10个柱床体积，然后用大量蒸馏水清洗，最后用结合缓冲液重新平衡。如果长时间不用或者是纯化其它蛋白，建议重新使用新的柱材料进行纯化。

4) 注意事项：

结合缓冲液可以随自己所需的要求进行适当更换，如可以使用PBS等其它buffer，但需注意的是，最好不要加入Mg2+，EDTA的浓度保持在2-5mM左右。

Beijing Cellgen Biolabs Co.,Ltd. www.cellgenbiolabs.com 层析柱在纯化之前溶胀，时间2-4小时，由于DNA与cellulose是物理偶联，所以不建议长时间溶胀后使用，重复使用次数不要超过三次。

八、 应用举例

实例1：将Sap1蛋白的基因重组于质粒pSSB-E4中，并对表达的融合蛋白SSB-Sap1进行纯化。

在E.coli中表达的SSB融合蛋白，每升细胞培养物可以得到3至30毫克蛋白。不同的目的蛋白，表达起伏较大。下面详细介绍用ssDNA-cellulose纯化融合蛋白SSB-Sap1并用凝血酶对标签蛋白进行切割。

Sap1在裂殖酵母中大量存在，分子量为~30kDa。通过PCR反应从裂殖酵母基因组DNA中扩增得到Sap1基因的DNA片段，插入到pSSB-E4载体的Bam HI和Hind III位点。通过筛选获得的编码融合蛋白6His-SSB-Sap1的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)pLysS细胞中，次日，挑取单菌落接到50ml含有50μg/ml卡那霉素LB培养基中培养过夜。过夜的菌液以1:100的比例接到新鲜的培养基中，在37℃培养至OD600为0.5左右，加IPTG到0.1mM的终浓度，继续37℃培养诱导3.5h，然后离心收集细胞，用含有0.4M NaCl的结合缓冲液（50 mM Tris-HCl (pH=8.0), 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol）悬浮菌体，超声破碎细胞，37000g离心30分钟。全细胞提取物，以及随后的细胞裂解液的沉淀和上清用SDS-PAGE检测，图一表明：6His-SSB-Sap1融合蛋白可溶性高，离心后约90%以上在上清中。由于Sap1蛋白对盐浓度较为敏感，所以我们选择先高盐得到可溶性蛋白后，将其稀释到100mM的盐浓度，高速离心后取上清再对其进行层析纯化。

Beijing Cellgen Biolabs Co.,Ltd. www.cellgenbiolabs.com Figure1: The overexpression of the fusion proteins 6His-SSB-Sap1 in E.coli BL21(DE3) plys cells.

用50 mM Tris-HCl (pH=8.0) ，5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol将6His-SSB-Sap1的盐浓度调到0.1M，再进行ssDNA-cellulose层析：

1. 层析柱先用TE清洗5-10个柱床体积以去除未偶联的DNA，后用结合缓

冲液平衡5-10个柱床体积。

2. 用注射器或蠕动泵加入已处理好的样品，为了获得最好的结果，上样时

可以调低流速或者重复上样。

3. 用结合缓冲液至少洗涤5-10个柱床体积，直到吸收达到平稳的基线或在

流出物中没有物质流出。

4. 低盐缓冲液50 mM Tris-HCl (pH=8.0) ，0.2M NaCl，5 mM EDTA, 2 mM

DTT, 10% glycerol洗涤柱子3-4个柱床体积以进一步去除非特异性结合的杂蛋白。

5. 用高盐缓冲液50 mM Tris-HCl (pH=8.0) ，0.4M NaCl，5 mM EDTA, 2 mM

DTT, 10% glycerol洗脱目的蛋白，分管收集。

纯化结果如图二所示，根据密度测定法，6His-SSB-Sap1的纯度可达到96%左右。

Beijing Cellgen Biolabs Co.,Ltd. www.cellgenbiolabs.com Figure2: The purification of 6His-SSB-Sap1 in E.coli cell extract with ssDNA-cellulose affinity chromatography.

取100μg6His-SSB-Sap1加入1单位的凝血酶在0.1M NaCl，2.5M CaCl2，50 mM Tris-HCl (pH=8.0)，5 mM EDTA, 2 mM DTT，10% glycerol中室温温育2到5个小时，如图三所示，6His-SSB-Sap1融合蛋白被凝血酶充分酶解，6His-SSB可以进一步通过镍-琼脂糖层析除去。

Figure3: Removal of 6His-SSB tag by Ni2+-NTA Agarose column after thrombin digestion.

实例2：将cds1基因重组入质粒pSSB-Y2中，并对表达的融合蛋白SSB-Cds1进行纯化

在酵母中表达的蛋白，一般表达量都很少，目的蛋白占总蛋白的量比例在1%左右甚至更低，只有用western-bloting才能检测出来，但是，酵母中表达的

Beijing Cellgen Biolabs Co.,Ltd. www.cellgenbiolabs.com 蛋白质一般不会形成包涵体，所以也是蛋白表达较好的一种宿主菌株。

Cds1基因全长1383bp，编码460aa，是一个DNA复制过程中细胞周期检验点中关键的蛋白激酶。将cds1的DNA片段插入到pSSB-Y2中的NotⅠ和BglⅡ的两个酶切位点之间，通过筛选获得编码融合蛋白6His-SSB-Cds1的质粒，通过电转化的方法转入酵母细胞LD330，在含有5μg/ml的维生素B1与不含有uracil的培养基EMM平板上32℃生长，约三四天后，将平板上适量的菌转入50ml含有5μg/ml的维生素B1的EMM液体培养基中培养，当菌体长到一定浓度后，收集菌体并用灭菌水洗菌体2-3次后，将培养基中的维生素B1去除干净，最后将其换至新鲜的不含有维生素B1的EMM培养基中诱导表达，12.5h后收集菌体并进行蛋白纯化。

用1.2M Sorbital将菌体悬起，加入10mM的DTT及适量的lyticase在30℃消化细胞，待90%的细胞在1% Triton X-100中为ghost cell时，立即加入buffer 1（50 mM Tris-HCl (pH=8.0) ，0.1M NaCl，5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol），同时加入蛋白酶抑制剂和终浓度为1%的Triton X-100，上下剧烈震荡几次后高速离心（15000rpm，4℃），得到的上清用ssDNA-celllulose柱子进行纯化。

1）

层析柱先用TE清洗5-10个柱床体积以去除未偶联的DNA，后用

buffer1平衡5-10个柱床体积。 2）

用注射器或蠕动泵加入已处理好的样品，为了获得最好的结果，上

样时可以调低流速或者重复上样。 3）

用buffer1至少洗涤5-10个柱床体积，直到吸收达到平稳的基线或在

流出物中没有物质流出。 4）

通过逐渐增加buffer1中的盐离子浓度达到纯化SSB-Cds1的目的.

纯化结果如图所示，我们得到了可以考染可见的SSB-Cds1样品，且纯度在70%以上。

Beijing Cellgen Biolabs Co.,Ltd. www.cellgenbiolabs.com Figure 4：The purification of SSB-Cds1 expressed in yeast cell extract with ssDNA-cellulose affinity chromatography.

九、 纯化方法的问题解决 十、 表三：纯化方法的问题解决 问题 可能原因 目的蛋白可能改变了SSB的构象或影响了SSB与ssDNA的结合，因此降低了SSB标签蛋白的结合能力。 当目的蛋白是非常大的时候，可能会碰到这个情况。 平衡时间太短 结合缓冲液中含有大量的镁离子 解决方法 降低样品上柱时的盐浓度或改变SSB融合到目的蛋白的N端或C端。 确认柱材料至少用5倍柱体积的pH6.5到8.0的缓冲液平衡过。 向溶液中加入5mM的EDTA，去除一些金属离子的干扰。 样品中过量的DNA会干扰SSB与层析柱的结合，建议先将样品进行DEAE柱层析，去除DNA后再进行ssDNA-cellulose层析。蛋白中的DNA酶有可能会降解ssDNA-cellulose柱子上的DNA，从而降低柱效，所以要加入一定量的EDTA抑制其活性。 SSB标签蛋白不结合柱子或者结合非常弱 样品中含有大量的DNA或DNA酶

Beijing Cellgen Biolabs Co.,Ltd. www.cellgenbiolabs.com 样品上样过程中流速过高 柱子重复使用多次需要清洗 洗脱缓冲液的体积不够 降低上样时的流速或进行多次上样。 可根据再生方法对柱子再生，或者更换新的柱材料。 增加洗脱缓冲液的体积。 通过降低洗脱过程中的流速来增加洗脱时间，对于离心方法，降低洗脱过程中的离心速度。 增加洗脱缓冲液中盐离子的浓度。 纯化过程中每一步都加入蛋白酶抑制剂，操作时在4℃进行。 抗体和宿主细胞蛋白交叉反应，可以设置阴性对照，排除干扰。 多余的条带可能由于共纯化一些分子伴侣所造成，这些分子伴侣参与宿主细胞中新生蛋白的正确折叠。 降低裂解时间，同时通过镜检检测，避免裂解过程中产生气泡，因为这样可能使标签蛋白变性或者发生降解。 SSB标签蛋白不能被高效的洗脱 洗脱的时间不够 洗脱缓冲液中的盐离子浓度太低 标签蛋白被蛋白酶部分降解 抗体和很多种宿主中自身表达的蛋白反应 电泳或蛋白质免疫印迹检测发现多条条带 分子伴侣可能被共纯化了 在机械裂解的过程中细胞破碎